白癜風(fēng)患者成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞的研究.pdf

1、目的：探討在體外將白癜風(fēng)患者白斑患處成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)成多功能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）的可能性，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)及表觀(guān)遺傳學(xué)方面的鑒定。
　　方法：
　　①獲得白癜風(fēng)患者白斑組織，通過(guò)貼壁法取得皮損處成纖維細(xì)胞（ vitiligo lesional fibroblast, VLF），包裝含有Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四種轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染 VLF

2、。在顯微鏡下觀(guān)察感染病毒后 VLF的形態(tài)變化。誘導(dǎo)至第12天后挑克隆傳代；
　?、趯?duì)重編程出的細(xì)胞鑒定：堿性磷酸酶（alkaline phosphatase, AP）染色、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)干性基因蛋白表達(dá)情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)內(nèi)源性干性基因表達(dá)及外源性四因子表達(dá)，OCT4基因啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化檢測(cè)，染色體核型分析以及畸胎瘤形成分析試驗(yàn)。
　　結(jié)果：
　　1.重編程白癜風(fēng)患者誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞
　?、僦鼐幊踢^(guò)程

3、中第4天開(kāi)始出現(xiàn)ES樣克隆細(xì)胞，并且隨培養(yǎng)天數(shù)增加長(zhǎng)大，有自我生長(zhǎng)能力；
　　②傳代后的VP-iPS（ vitiligo patient specific-induced pluripotent stem cell, VP-iPS cell）細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞核排列緊密，細(xì)胞可見(jiàn)很高的核質(zhì)比。
　　2.鑒定白癜風(fēng)患者誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞
　?、?AP染色顯示VP-iPS細(xì)胞為未分化狀態(tài)；
　?、诩?xì)胞免疫熒光顯示干性基

4、因 OCT4、NANOG、TRA-1-60、SSEA4蛋白水平表達(dá)陽(yáng)性；
　?、?qRT-PCR檢測(cè)內(nèi)源性干性基因Oct4、Sox2、Nanog、hTERT、Rex1、DNMT3B、GDF3，與陰性對(duì)照比較表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）,檢測(cè)外源性四因子基因與陽(yáng)性對(duì)照比較表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；
　?、苤貋喠蛩猁}測(cè)序顯示VP-iPS細(xì)胞OCT4基因啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)槿ゼ谆癄顟B(tài)， VLF細(xì)胞則為甲基化狀態(tài)；