水牛胎兒成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染hTERT基因及其核移植效果的研究.pdf

1、胎兒成纖維細(xì)胞是常用的體細(xì)胞核移植供體細(xì)胞類型,但由于存在體外培養(yǎng)代次有限、轉(zhuǎn)基因后損傷大等問題,限制了其在體細(xì)胞核移植中的應(yīng)用。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的核心成分,在端粒酶延長端粒過程中發(fā)揮重要的作用。本研究擬通過構(gòu)建hTERT基因的真核表達(dá)載體,導(dǎo)入水牛胎兒成纖維細(xì)胞中,以期延長水牛胎兒成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)壽命,獲得一株經(jīng)得起基因修飾和長時間藥物篩選的細(xì)胞系,從而提高生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆動物的效率。
　　首先,本研究成

2、功構(gòu)建了 hTERT基因的兩個逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pMXs-hTERT-NEO-GFP和pMXs-hTERT-IRES-NEO;并用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)得到了形態(tài)良好、增殖能力強的水牛胎兒成纖維細(xì)胞;同時,運用逆轉(zhuǎn)錄病毒法將構(gòu)建好的載體 pMXs-hTERT-NEO-GFP和pMXs-hTERT-IRES-NEO導(dǎo)入水牛胎兒成纖維細(xì)胞;通過高壓篩選(800μg/mL G418)和恒壓篩選(200μg/mL G418)相結(jié)合的方式得到陽性克

3、隆并進(jìn)行了擴大培養(yǎng),獲得了轉(zhuǎn)hTERT基因的陽性細(xì)胞株。
　　其次,比較了導(dǎo)入 pMXs-hTERT-IRES-NEO載體的水牛胎兒成纖維細(xì)胞(phn-BFF)、導(dǎo)入 pMXs-hTERT-NEO-GFP載體的水牛胎兒成纖維細(xì)胞(phnG-BFF)和未轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞(BFF)中hTERT基因的相對表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)hTERT基因在第5代和第30代phn-BFF的相對表達(dá)量差異不顯著(P>0.05),但均極顯著高于第5代phnG-BF

4、F和第5代BFF(P<0.01),而第5代 phnG-BFF的hTERT基因相對表達(dá)量也極顯著高于第5代 BFF(P<0.01)。同時,還對第30代phn-BFF的核型、細(xì)胞周期、端粒酶活性、端粒酶蛋白表達(dá)、軟瓊脂生長能力及 p53基因表達(dá)量等生物學(xué)特性進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示:第30代phn-BFF的核型正常率為85％,其細(xì)胞周期與第5代BFF的相比,處于分裂期(S期)的細(xì)胞明顯增多(phn-BFF38.6%>BFF25.5%,P<0.05

5、),處于合成前期(G0+G1)的細(xì)胞減少(phn-BFF45.4%

6、的P53基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。
　　最后,分別以第5代和第30代BFF、第30代phn-BFF作為供體細(xì)胞進(jìn)行體細(xì)胞核移植(SCNT),探討了轉(zhuǎn)hTERT基因的BFF作為供體細(xì)胞對水牛核移植重構(gòu)胚發(fā)育能力及胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:第30代phn-BFF作為供體細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚其融合率、卵裂率和囊胚率與第5代 BFF的相比差異不顯著(P>0.05),但顯著高于第30代 BFF組(P<0.05)。采用Q-

7、PCR分別檢測第5代、第30代BFF和第30代phn-BFF構(gòu)建的核移植重構(gòu)胚囊胚 Cdx2和Cx43基因的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)第30代phn-BFF構(gòu)建的核移植囊胚的Cdx2基因的相對表達(dá)量顯著高于第30代BFF組(P<0.05),但與第5代BFF組差異不顯著(P>0.05);Cx43基因在第30代 phn-BFF中的表達(dá)量高于第5代和第30代 BFF組,且存在顯著差異(P<0.05)。
　　以上結(jié)果表明:水牛胎兒成纖維細(xì)胞導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄