鴨圓環(huán)病毒ORF3基因的克隆表達(dá)及其單克隆抗體的制備與應(yīng)用.pdf

1、鴨圓環(huán)病毒被歸類于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，該病毒ORF3所編碼的蛋白功能目前尚未闡釋。為了制備針對(duì)該蛋白的單克隆抗體，給進(jìn)一步探索該蛋白功能提供素材，論文對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定的DuCV ORF3基因開(kāi)展了以下實(shí)驗(yàn):DuCV ORF3基因的生物信息學(xué)分析、ORF3基因的克隆表達(dá)及純化、單克隆抗體的制備、間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立和應(yīng)用，結(jié)果如下:
　　1.DuCV ORF3的生物信息學(xué)分析
　　GH01株DuCV全長(zhǎng)1988bp

2、，ORF3基因A、T、G、C含量分別為21.89％、25.25％、24.58％、28.28％，共297bp，位于全基因組第399至第103位堿基，編碼98個(gè)氨基酸，分子量約11.6 KD。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)則卷曲占大部分，含量約為62.3％，α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)分別占31.6％和6.1％;沒(méi)有保守區(qū)、信號(hào)肽、跨膜區(qū)，提示該蛋白可能是該病毒進(jìn)化的關(guān)鍵蛋白，且既不是分泌性蛋白也不是跨膜蛋白;有三個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，沒(méi)有糖基化位點(diǎn);抗原表

3、位主要集中在第2～12、第35～40、第49～53、第62～65、第72～75、第77～84位氨基酸，免疫原性良好。
　　2.DuCV ORF3基因的克隆表達(dá)及純化
　　PCR特異性擴(kuò)增ORF3基因后進(jìn)行T-A克隆，再用EcoRⅠ和XhoⅠ這兩種內(nèi)切酶消化后連接到表達(dá)載體上，成功構(gòu)建了重組原核表達(dá)載體:pET-32a-ORF3和pGEX-6p-ORF3。重組載體分別轉(zhuǎn)化進(jìn)Rosetta(DE3) E.coli菌后用IPTG成

4、功誘導(dǎo)表達(dá)了30 KD和35 KD的ORF3融合蛋白，與預(yù)期大小一致，對(duì)pET-32a-ORF3的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8mM，而對(duì)pGEX-6p-ORF3是0.2mM，這兩種融合蛋白都主要是以包涵體的形式存在。利用Ni2+親和層析及包涵體洗滌和SDS-PAGE切膠回收相結(jié)合的方法分別純化pET-32a-ORF3和pGEX-6p-ORF3重組蛋白，得到了高純度的蛋白。Western Blot檢測(cè)顯示這兩種蛋白均能夠與鴨圓環(huán)病毒陽(yáng)性血

5、清特異性結(jié)合，表明它們都具有免疫學(xué)活性。
　　3.DuCV ORF3單克隆抗體的制備
　　純化的pET-32a-ORF3蛋白經(jīng)梯度復(fù)性后以100μg/只腹腔注射Balb/c雌性小鼠進(jìn)行免疫，效價(jià)達(dá)到104后，將骨髓瘤細(xì)胞與其脾細(xì)胞按1∶4的比例混勻，在PEG4000作用下進(jìn)行融合反應(yīng)。用建立的間接ELISA法（最佳抗原包被濃度1μg/孔）篩選陽(yáng)性細(xì)胞，融合率為25％。經(jīng)過(guò)3次有限稀釋，最終達(dá)到100％的陽(yáng)性，獲得4株穩(wěn)定分泌

6、抗ORF3抗體的雜交瘤細(xì)胞（依次命名為1、2、3、4號(hào)）。利用ORF3陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞制備腹水型抗體，抗體的效價(jià)在1∶25600～1∶102400之間，均為IgM亞類，并能夠與ORF3蛋白特異性結(jié)合。
　　4.間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的建立與應(yīng)用
　　利用純化的pET-32a-ORF3融合蛋白作為包被抗原，建立了穩(wěn)定可靠的DuCV ORF3抗體的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA免疫學(xué)檢測(cè)方法。利用棋盤滴定法優(yōu)化包被抗原和腹水單抗的最佳梯度，再

7、確定出最優(yōu)血清稀釋度、競(jìng)爭(zhēng)作用時(shí)間和cut-off判定值。結(jié)果表明該方法的最佳條件為pET-32a-ORF3純化蛋白以1μg/孔包被，5％BSA封閉后，1∶800的DuCV陽(yáng)性血清37℃放置30min，直接加入1∶4000的腹水型單克隆抗體，混勻后37℃競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)40 min，HRP-羊抗鴨Ig G二抗孵育再TMB顯色。該檢測(cè)方法cut-off判定值為10.9％，只特異性的與DuCV陽(yáng)性血清反應(yīng)，靈敏度為血清稀釋1∶1600倍。將該方法與