丙戊酸鈉、卡馬西平和托吡酯對(duì)戊四氮點(diǎn)燃大鼠模型肝臟和腎臟影響的研究.pdf

1、目的：癲癇(epilepsy，EP)是神經(jīng)系統(tǒng)最常見的慢性反復(fù)發(fā)作性疾病之一，是由各種原因引起的腦功能障礙綜合征，是腦細(xì)胞群異常超同步化放電而引起的發(fā)作性的、突然的、暫時(shí)的腦功能紊亂癥。迄今為止，在臨床中，抗癲癇藥物(antiepileptic drugs，AEDs)仍然是癲癇治療的主要手段，甚至有一部分癲癇患者需要終生服用AEDs，因此癲癇患者的生活質(zhì)量的保證備受關(guān)注。影響癲癇患者生活質(zhì)量的因素有很多，如發(fā)作類型及嚴(yán)重程度、發(fā)作頻率、

2、藥物的不良反應(yīng)、病程等，其中發(fā)作頻率和藥物的不良反應(yīng)是影響癲癇患者生活質(zhì)量的主要因素。減少不良反應(yīng)的發(fā)生成為癲癇患者最關(guān)心的問(wèn)題之一。本試驗(yàn)主要是研究在服用抗癲癇藥物過(guò)程中出現(xiàn)肝臟、腎臟異常與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞死亡方式，其研究主要集中在Fas/FasL的表達(dá)。Fas配體(FasL)與Fas受體(FasR)分別屬腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor，TNF)及TNF受體(tumor necrosis f

3、actorreceptor，TNFR)家族，是以膜分子或可溶性分子形式存在于細(xì)胞表面介導(dǎo)凋亡的蛋白質(zhì)分子。本試驗(yàn)利用戊四氮(Pentvlenetetrazole,PTZ)成功點(diǎn)燃動(dòng)物模型共30只，將動(dòng)物分成五組，即實(shí)驗(yàn)組分為丙戊酸鈉(Valproic acid,VPA)組、卡馬西平(Carbamazepine,CBZ)組、托吡酯(Topiramate,TPM)組；對(duì)照組分為戊四氮(PTZ)組、生理鹽水(NS)組。實(shí)驗(yàn)組分別給予成人體重平

4、均劑量的25倍藥物進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組分別給予同劑量的PTZ和NS。通過(guò)HE染色觀察肝臟、腎臟細(xì)胞的形態(tài)；免疫組化觀察肝臟和腎臟的凋亡蛋白Fas和FasL表達(dá)情況，從而得到抗癲癇藥物在癲癇患者的治療過(guò)程中肝臟、腎臟異常與細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。方法： 1.癲癇動(dòng)物模型的建立：健康10周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠35只(體重200±20g)。給予大鼠每日按體重35mg/kg腹腔注射1％戊四氮(PTZ)一次，對(duì)照組每日腹腔

5、注射等量的生理鹽水，20天后觀察大鼠行為學(xué)的變化。依據(jù)Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)：無(wú)任何反應(yīng)；1級(jí)：面部陣攣，包括眨眼、動(dòng)須、節(jié)律性咀嚼；2級(jí)：1級(jí)基礎(chǔ)加節(jié)律性點(diǎn)頭；3級(jí)：2級(jí)加前肢陣攣；4級(jí)：3級(jí)加后肢站立；5級(jí)：4級(jí)加摔倒。對(duì)動(dòng)物逐個(gè)進(jìn)行觀察記錄，凡已獲得連續(xù)3次Ⅱ級(jí)或Ⅲ級(jí)以上發(fā)作者，被認(rèn)為完全點(diǎn)燃。共造模成功30只，按隨機(jī)分組的方法將大鼠分為VPA組(n=6)，CBZ組(n=6)，TPM組(n=6)，PTZ組(n=6)和NS組(n

6、=6)。造模過(guò)程中大鼠死亡2只(致癲過(guò)程中動(dòng)物出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)，導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡)，不合格模型3只(癇性發(fā)作未達(dá)到Ⅲ級(jí)以上)均予以剔除，保證每組動(dòng)物6只。 2.癲癇模型的藥物干預(yù)：癲癇模型完全點(diǎn)燃后，VPA組，CBZ組和TPM組按成人體重平均劑量的25倍用自制的灌胃器進(jìn)行藥物干預(yù)，對(duì)照組PTZ組及NS組給予等量生理鹽水，時(shí)間共20天，并觀察癲癇大鼠的行為學(xué)變化。 3.動(dòng)物取材：用4％的戊二醛從左心室進(jìn)行灌注1.5小時(shí)后

7、，將SD大鼠的腹腔剖開，取肝臟左葉和左腎組織，體積塊1cm3，迅速放入4％的多聚甲醛固定液中，24小時(shí)后進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)切片做HE染色和免疫組化。 4 HE染色：標(biāo)本做成石蠟切片后，經(jīng)蘇木素-伊紅染色后在光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。 5 免疫組化：標(biāo)本做成石蠟切片后，經(jīng)抗原修復(fù)、山羊血清封閉后，加Fas和FasL多克隆抗體，在經(jīng)二抗、三抗孵育，DAB顯色后置顯微鏡下觀察記錄。 結(jié)果： 1.各種抗癲癇藥物對(duì)癲癇大鼠的控制情

8、況：各組大鼠均出現(xiàn)了不同程度的癇性發(fā)作，生理鹽水組無(wú)癇性發(fā)作，在進(jìn)行灌胃處理后，實(shí)驗(yàn)組大鼠的癇性發(fā)作明顯減少，而PTZ組大鼠癇性發(fā)作未見減少，NS組未見癇性發(fā)作。 2.HE染色：光鏡下肝臟、腎臟細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變：PTZ組、CBZ組和NS組可以見到肝細(xì)胞排列整齊，肝細(xì)胞核皇圓形或類圓形，可見較大核仁，肝竇、肝索結(jié)構(gòu)正常；腎臟的腎小球及腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常；而VPA組、TPM組的肝臟中央靜脈周圍肝細(xì)胞及腎臟腎小管上皮細(xì)胞可見空泡樣

9、變，腎小管輕度萎縮或管腔擴(kuò)張，上皮細(xì)胞腫脹，胞漿內(nèi)可見小脂肪空泡。 3.免疫組化 3.1藥物干預(yù)后各組肝臟細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率比較： VPA組與TPM組比較差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05)VPA組與CBZ組、PTZ組、NS組比較差異有顯著性(P＜0.05)TPM組與CBZ組、PTZ組、NS組的比較差異有顯著性(P＜0.05)。 CBZ組、PTZ組及NS組組間比較沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。

10、 3.2藥物干預(yù)后各組腎臟細(xì)胞Fas、FasL蛋白表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞率比較： VPA組與TPM組比較差異沒(méi)有顯著性(P＞0.05)VPA組與CBZ組、PTZ組、NS組比較差異有顯著性(P＜0.05)TPM組與CBZ組、PTZ組、NS組的比較差異有顯著性(P＜0.05)CBZ組、PTZ組及NS組組間比較沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.HE染色觀察癲癇大鼠的肝臟、腎臟細(xì)胞光鏡下的形態(tài)，丙戊酸鈉、托吡酯組大