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文檔簡介
1、目的:目前為止,癲癇的發(fā)病機制和病因?qū)W還不是特別清楚,已在許多顳葉癲癇模型和顳葉癲癇病人的海馬上發(fā)現(xiàn)諸如進行性神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細胞增生和突觸重建等神經(jīng)可塑性改變。癲癇形成中的神經(jīng)可塑性研究已經(jīng)成為當前癲癇研究的熱點。點燃是研究癲癇形成和神經(jīng)可塑性的一個理想模型。托吡酯是一種新型抗癲癇藥,通過多重作用機制發(fā)揮抗癲癇作用。本研究通過戊四氮點燃大鼠模型,觀察戊四氮點燃過程中大鼠行為、腦電活動變化以及突觸重建標記物生長相關蛋白43、膠質(zhì)細胞增生
2、標志物膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白和細胞因子白介素-6在海馬表達的變化及托吡酯對其變化的影響,探討神經(jīng)可塑性在癲癇發(fā)病中的作用,從而為新的治療思路提供理論依據(jù)。 方法:1.健康成年雄性SD大鼠80只,隨機分為4組,每組20只。Ⅰ組大鼠胃管內(nèi)注入生理鹽水(10ml/kg)后1小時腹腔注射10g/L戊四氮(35mg/kg);Ⅱ組和Ⅲ組大鼠腹腔注射戊四氮(劑量同Ⅰ組大鼠)前1小時分別按100mg/kg和40mg/kg胃灌注10g/L托吡酯生理
3、鹽水溶液;Ⅳ組大鼠按10ml/kg和3.5ml/kg分別胃灌注和腹腔注射生理鹽水,間隔1小時。均每日一次。注射完畢后觀察1小時,記錄癇性發(fā)作的潛伏期及癇性發(fā)作級別。各組選取2個研究時間點,又相應分為兩個亞組,分別為Ⅰ組大鼠行為達到Ⅲ級和Ⅴ級時,每個時間點各組大鼠為10只。 2.在每個時間點,各組大鼠做腦電圖描記。除對照組外,余三組均在描記中腹腔注射相同劑量戊四氮,用藥前描記腦電圖10分鐘,用藥后至少連續(xù)描記30分鐘。 對
4、所有大鼠的腦電圖進行定量分析。描記后將大鼠處死。 3.應用免疫組織化學方法檢測不同時間點各組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)和CA1區(qū)內(nèi)生長相關蛋白43、膠質(zhì)纖維酸性蛋白和細胞因子白介素-6的表達。相關結果經(jīng)圖像分析系統(tǒng)進行定量分析。 4.應用逆轉錄聚合酶聯(lián)反應,半定量檢測不同時間點各組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)內(nèi)生長相關蛋白43、膠質(zhì)纖維酸性蛋白mRNA的表達。 結果:1.Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠腹腔注射戊四氮后,
5、Ⅰ組大鼠在連續(xù)腹腔注射10天后陸續(xù)出現(xiàn)1-2級發(fā)作,約2周達到Ⅲ級。Ⅱ組和Ⅲ組大鼠于用藥后兩周出現(xiàn)1-2級發(fā)作,4周時,Ⅰ組所有動物達到點燃狀態(tài),而Ⅱ組和Ⅲ組大鼠最高發(fā)作級別為3級。對照組大鼠行為正常,無癇性發(fā)作。 2.腦電圖描記時間為2周和4周。對照組的腦電記錄顯示正常。2周及4周時,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠腦電記錄可見癲癇波發(fā)放,Ⅰ組大鼠腦電記錄到的癲癇波多于Ⅱ組和Ⅲ組大鼠。與Ⅰ組大鼠相比,Ⅱ組和Ⅲ組大鼠發(fā)作的潛伏期延長,持續(xù)時
6、間縮短(均p<0.05)。2周時Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠注射PTZ后總功率、δ、θ和α功率均增加(p<0.05或p<0.01),β功率無顯著性改變(P>0.05)。4周時,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠除Ⅰ組大鼠β功率無顯著性改變外(P>0.05),注射PTZ后總功率和其他各頻段功率均增加(p<0.05或p<0.01)。 3.在同一個時間點,與對照組相比,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠CA3區(qū)苔狀纖維層,齒狀回的內(nèi)分子層及上顆粒層生長相關蛋白43免疫反
7、應著色增強,圖像分析結果顯示,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠CA3區(qū)苔狀纖維層,齒狀回的內(nèi)分子層及上顆粒層免疫反生長相關蛋白43映光密度值比對照組均有統(tǒng)計學意義的增高(p<0.05);與Ⅰ組相比,Ⅱ組和Ⅲ組大鼠GAP-43免疫反應光密度值有統(tǒng)計學意義的降低(p<0.05),Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間無差異(P>0.05)。與兩周時相比,四周時Ⅰ組,Ⅱ組和Ⅲ組大鼠CA3區(qū)苔狀纖維層,齒狀回的內(nèi)分子層及上顆粒層生長相關蛋白43免疫反應著色進一步變強,與兩周時
8、相比生長相關蛋白43免疫反應光密度值有統(tǒng)計學意義的增高(p<0.05)。 4.在同一個時間點,與對照組相比,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回及海馬CA各區(qū)膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白免疫陽性反應增強,以齒狀回的門區(qū)及CA1腔隙-分子層更顯著,可見膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白免疫陽性反應細胞增多,膠質(zhì)細胞胞體肥大不明顯,突起增多,免疫陽性細胞計數(shù)有顯著性差異(p<0.05)。Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白免疫陽性反應細
9、胞數(shù)較Ⅰ組減少,有顯著性差異(p<0.05),而Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間無顯著性差異(p>0.05)。與兩周時相比,四周時Ⅰ組Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、CA1區(qū)及CA3區(qū)膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白免疫陽性反應進一步增強,免疫反應陽性細胞數(shù)進一步增多,與兩周時有顯著性差異(p<0.05)。 5.2周時,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)內(nèi)白介素6免疫反應均比對照組增強(均p<0.05),表現(xiàn)為陽性反應細胞數(shù)目增多,著色明顯加深,三
10、組之間光密度值無顯著性差異(P>0.05)。4周時,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)內(nèi)白介素6免疫反應進一步增強(p<0.05),Ⅰ組比Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回、海馬CA3區(qū)及CA1區(qū)內(nèi)白介素6免疫反應更明顯,差異有顯著性(均p<0.05),而Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間光密度值無顯著性差異(P>0.05)。 6.生長相關蛋白43mRNA逆轉錄聚合酶聯(lián)反應產(chǎn)物經(jīng)溴乙啶顯色后清晰地顯示出256bp和385bp兩個預期的條帶,Ⅳ
11、組大鼠之間齒狀回、CA1區(qū)及CA3區(qū)的生長相關蛋白43mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。在同一時間點,Ⅰ組,Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回及CA3區(qū)的生長相關蛋白43mRNA表達強于對照組(p<0.05),各組在海馬CA1區(qū)生長相關蛋白43mRNA表達無差異;Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回和CA3區(qū)的生長相關蛋白43mRNA表達水平較Ⅰ組有統(tǒng)計學意義的降低(p<0.05),而Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間齒狀回和CA3區(qū)的生長相關蛋白43mRNA表達水平無
12、統(tǒng)計學差異(p>0.05)。與2周時相比,四周時Ⅰ組大鼠,Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回和CA3區(qū)的生長相關蛋白43mRNA表達水平進一步增強(p<0.05)。 7.膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA逆轉錄聚合酶聯(lián)反應產(chǎn)物經(jīng)溴乙啶顯色后清晰地顯示出256bp和385bp兩個預期的條帶,Ⅳ組大鼠之間齒狀回,CA1區(qū)及CA3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異(p>0.05)。在同一時間點,Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回,CA1區(qū)及CA
13、3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達強于對照組(p<0.05),與Ⅰ組相比,Ⅱ組和Ⅲ組大鼠齒狀回,CA1區(qū)及CA3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達水平有顯著的下降(p<0.05)。而在不同時間點,Ⅱ組和Ⅲ組大鼠之間齒狀回,CA1區(qū)及CA3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達水平無差異(p>0.05)。與2周時相比,Ⅰ組大鼠、Ⅱ組和Ⅲ組齒狀回,CA1區(qū)及CA3區(qū)的膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白mRNA表達水平進一步增強(p<0.05).
14、 結論:1.戊四氮點燃大鼠海馬生長相關蛋白43、膠質(zhì)原纖維酸性蛋白和白介素-6的表達增強,表明反應性膠質(zhì)細胞增生、突觸重建和免疫系統(tǒng)激活參與了癲癇發(fā)生的病理過程。 2.托吡酯對戊四氮點燃的大鼠癲癇發(fā)作行為有抑制作用,兩種劑量的抑制作用無差異。 3.腦電圖定量分析顯示托吡酯可抑制戊四氮點燃的大鼠大腦神經(jīng)元癲癇樣放電。 4.托吡酯可抑制戊四氮點燃大鼠海馬生長相關蛋白43、膠質(zhì)細胞纖維酸性蛋白和白介素-6的過表達,兩
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