雌激素缺乏導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中TNF-α通過MiR-21影響小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化能力的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)是絕經(jīng)后婦女的高發(fā)病癥,系代謝性骨病變,表現(xiàn)為單位體積內(nèi)骨組織量減少,其特點為骨形成與骨吸收平衡紊亂。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)病過程的早期,破骨活動加強,成骨也隨之代償性加強,但隨著病程的進展,由于雌激素(estrogen,E2)缺乏引起一些炎癥因子,例如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(IFN-γ)水平升高,使

2、成骨活動受到抑制,從而導(dǎo)致成骨破骨的平衡被打破,引起骨量喪失。目前對PMOP發(fā)病過程中炎癥因子,尤其是TNF-α促進破骨的研究很多,其機制也逐漸被闡明,而關(guān)于TNF-α抑制成骨的機制并不明確。
  骨形成主要為成骨細胞的成熟礦化,而骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow stromal cells,mBMSCs)是成骨細胞的前體細胞。BMSCs向成骨細胞分化的能力,將直接影響到機體的骨形成。近年來一些研究表明PMOP發(fā)病過程中m

3、BMSCs的成骨功能受損,但是參與其中的分子機制目前尚不清楚。
  MicroRNA(miRNA)是一種非編碼小分子RNA,長度為19~25個核苷酸序列,具有高度的組織特異性和序列保守性。近年大量研究已經(jīng)表明,一些miRNA在干細胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)進程以及一些腫瘤及炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。其作用機制是它們識別于特定的靶mRNA,并與后者3’非翻譯區(qū)相結(jié)合,于轉(zhuǎn)錄后負向調(diào)控后者表達。PMOP的環(huán)境是一種炎癥微環(huán)

4、境,那么在這種的微環(huán)境中,miRNA的調(diào)控作用是否會受到影響?以及會受到怎樣的影響?受到影響的miRNA調(diào)控作用是否會導(dǎo)致到干細胞的成骨分化受到影響?其分子機制又是如何?為了回答這些問題,本研究通過建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松C57小鼠模型,對其與假手術(shù)組(Sham)的mBMSCs進行miRNA芯片掃描,并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù),篩選出關(guān)鍵microRNA(miR-21)。研究miR-21在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松微環(huán)境中對骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化

5、的調(diào)控作用,將有助于進一步加深對PMOP的致病機理的了解,為PMOP的治療提供新的思路和方法。
  研究目的
  (1)尋找雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境下調(diào)控mBMSCs成骨的關(guān)鍵miRNA(miR-21)。
 ?。?)探討在miR-21在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松微環(huán)境下是否參與調(diào)控mBMSCs成骨及其在此種微環(huán)境下對成骨的調(diào)控作用。
  (3)探討在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中炎癥因子對miR-21的調(diào)

6、控,以及對mBMSCs成骨影響的分子機制。
  研究方法
  (1)建立去勢(OVX)動物模型,通過microCT、組織學(xué)方法以及real time RT-PCR、western blot、茜素紅和ALP染色等技術(shù)觀察OVX小鼠BMSCs(mBMSCs)的成骨能力,Elisa方法檢測OVX小鼠體內(nèi)E2,各種炎癥因子的水平。
 ?。?)通過生物信息學(xué)技術(shù)以及microRNA基因芯片技術(shù)對OVX組和Sham組的C57BL/

7、6J小鼠來源的mBMSCs進行對比篩選,確定調(diào)控mBMSCs成骨的關(guān)鍵miRNA(miR-21)。利用real time RT-PCR技術(shù)驗證miR-21在OVX及Sham組mBMSCs成骨分化過程中的表達差異。通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)和下調(diào)miR-21,real time RT-PCR、western blot、茜素紅和ALP染色等技術(shù)觀察轉(zhuǎn)染后mBMSCs的成骨能力。
 ?。?)在成骨誘導(dǎo)的過程中,分別用IFN-γ(0.1ng/m

8、L)、IL-1β(1ng/mL)和TNF-α(10ng/mL)刺激正常C57小鼠來源的mBMSCs,real time RT-PCR技術(shù)檢測miR-21的表達。對照芯片結(jié)果,篩選出主要影響miR-21的炎癥因子(TNF-α)。在TNF-α刺激下,過表達miR-21,real time RT-PCR和western blot技術(shù)分別檢測成骨相關(guān)基因的表達情況。
 ?。?)通過分別注射E2和TNF-α中和抗體至OVX后C57小鼠體內(nèi),

9、檢測其體內(nèi)TNF-α水平及miR-21的表達,體內(nèi)驗證miR-21雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中的成骨分子機制。
  結(jié)果:
  1、成功建立小鼠 OVX模型,OVX組骨密度明顯低于 Sham組,OVX組mBMSCs的成骨能力低于Sham組,OVX小鼠體內(nèi)E2水平降低,各種炎癥因子的水平升高。
  2、通過生物信息學(xué)技術(shù)以及microRNA基因芯片技術(shù)篩選,確定調(diào)控mBMSCs成骨的關(guān)鍵miRNA:miR-21。re

10、al time RT-PCR顯示miR-21在OVX組mBMSCs成骨分化中的水平較Sham組低。轉(zhuǎn)染miR-21至OVX組mBMSCs,能部分恢復(fù)其成骨分化能力。
  3、篩選出主要影響miR-21的炎癥因子:TNF-α。在TNF-α刺激下,mBMSCs成骨能力降低,miR-21表達水平降低。轉(zhuǎn)染miR-21至TNF-α刺激下的mBMSCs,real time RT-PCR、western blot、茜素紅和ALP染色等技術(shù)提示

11、miR-21能部分恢復(fù)其成骨分化能力。
  4、注射E2和TNF-α中和抗體至OVX小鼠體內(nèi),結(jié)果顯示OVX組小鼠體內(nèi)TNF-α水平回落,miR-21水平回升,股骨骨密度增高。
  結(jié)論:
  1、miR-21是雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中調(diào)控mBMSCs成骨分化的關(guān)鍵miRNA。
  2、miR-21在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松環(huán)境中能促進 mBMSCs的成骨分化。
  3、在雌激素缺乏所導(dǎo)致的骨質(zhì)疏

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