KLF4的SUMO化修飾促進(jìn)IL-4誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化.pdf

1、目的：
　　到目前為止，在哺乳動(dòng)物中，KLFs(Krüppel-like factors)家族已經(jīng)有十七個(gè)成員被鑒定出來，它們均屬于DNA結(jié)合蛋白中的鋅指結(jié)構(gòu)家族，故具有轉(zhuǎn)錄活性。KLFs通過其鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合到DNA上的CACCC元件和GC豐富區(qū)域，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的生物學(xué)功能，并由此廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、遷移、炎癥、凋亡等生命活動(dòng)過程。KLF4作為該家族中重要的一員，在細(xì)胞的生長、分化以及凋亡等生物學(xué)功能中具有十分重

2、要的作用。
　　SUMO(Small Ubiquitin-related Modifier Protein)化修飾是將SUMO小分子（SUMO1/2/3，人中有SUMO4，一種類泛素蛋白）共價(jià)結(jié)合到一系列底物蛋白上的一種翻譯后修飾方式。SUMO化修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)且可逆的過程，通過特異性的E1激活酶、E2結(jié)合酶、E3連接酶的特異性催化作用，將SUMO小分子共價(jià)結(jié)合在底物蛋白質(zhì)特定的賴氨酸殘基上，最終影響底物蛋白的生物學(xué)活性以及在細(xì)胞中

3、的定位。而其可逆反應(yīng)（去SUMO化修飾）則是由一類被稱為SENPs(SUMO-specificproteases)的特異性蛋白酶來催化完成。
　　巨噬細(xì)胞是機(jī)體天然免疫中的重要組成部分，并且在炎癥反應(yīng)以及機(jī)體免疫抵抗中發(fā)揮著十分重要的作用。由于單核-巨噬細(xì)胞系具有多樣性以及可塑性等重要的特點(diǎn)，因此在組織中，單核-巨噬細(xì)胞可對不同的微環(huán)境會(huì)表現(xiàn)出不同的表型。根據(jù)組織微環(huán)境中的不同信號(hào)，巨噬細(xì)胞可以進(jìn)行經(jīng)典(M1)活化(Classic

4、allyactivated)（由TLR配體或者IFN-γ誘導(dǎo)）或者非經(jīng)典(M2)活化(Alternativeactivated)（由IL-4或者IL-13誘導(dǎo)）。M1型巨噬細(xì)胞表現(xiàn)為促炎的效應(yīng)，而M2型巨噬細(xì)胞則表現(xiàn)為抗炎的活性。
　　2011年Liao等人的研究表明，KLF4在巨噬細(xì)胞向M2型極化的過程中發(fā)揮了重要的作用，但KLF4調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的具體機(jī)制還有待深入。已有研究發(fā)現(xiàn)，KLF4是一種可以發(fā)生SUMO化修飾的蛋白。在

5、本論文的研究中，我們將致力于揭示KLF4的SUMO化修飾在巨噬細(xì)胞向M2型極化過程中的重要作用。
　　材料與方法：
　　1.所用細(xì)胞系、質(zhì)粒和抗體
　　細(xì)胞系:HEK-293T,HEK-293,RAW264.7,BMDM(Bone marrow derivedmacrophages), MEF(mouse embryonic fibroblast)細(xì)胞。
　　質(zhì)粒:pShuttle-CMV, pAdEasy-1,

6、 PXPAX2, PMD, PCDH-GFP vector;PCDNA3.1-vector, PCDNA3.1-HA-KLF4, PCDNA3.1-HA-KLF4-K278R,PCDNA3.1-FLAG-SUMO1, FLAG-SENP1, FLAG-SENP2, PCDNA3.1-GFP,RGS-SENP1、 RGS-SENP1 mutant。
　　抗體:FLAG M2和HA（Sigma公司）、RGS（Qiagen公司）、SUM

7、O1（Abcam公司）、KLF4（Santa Cruz公司）、ACTIN（Cell Signaling Technology公司）。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　采用細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)、利用逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建KLF4穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系、利用腺病毒構(gòu)建KLF4過表達(dá)細(xì)胞、小鼠骨髓來來巨噬細(xì)胞的獲取和誘導(dǎo)、蛋白質(zhì)印跡技術(shù)、蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)、RNA抽提技術(shù)、反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)技術(shù)、實(shí)時(shí)定量PCR、染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)等。
　　

8、結(jié)果：
　　1)人來源的KLF4可以在K278位點(diǎn)發(fā)生SUMO化修飾;
　　2)在RAW264.7細(xì)胞系中內(nèi)源性KLF4可發(fā)生SUMO化修飾;
　　3)SENP1與KLF4可以發(fā)生相互作用;
　　4)SENP1介導(dǎo)KLF4發(fā)生去SUMO化修飾;
　　5)在SENP1敲除的MEF細(xì)胞中KLF4的SUMO化修飾增強(qiáng);
　　6)IL-4可以增強(qiáng)KLF4的SUMO化修飾;
　　7)在RAW264.7細(xì)胞

9、中用IL-4刺激，KLF4的SUMO化修飾可以增強(qiáng)巨噬細(xì)胞M2型標(biāo)志基因的表達(dá);
　　8)在IL-4的刺激下，KLF4的SUMO化修飾可以增加KLF4在Arg-1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合;
　　9)在BMDM細(xì)胞中用IL-4刺激，KLF4的SUMO化修飾可以增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá);
　　10)在BMDM細(xì)胞中KLF4的SUMO化修飾促進(jìn)細(xì)胞向M2型極化。
　　結(jié)論：
　　1)KLF4可以發(fā)生SUMO化修飾，