山羊KLF4基因克隆、原核表達(dá)和His-klf4融合蛋白純化.pdf

1、[目的]Klf4是維持干細(xì)胞多能性的轉(zhuǎn)錄因子之一，在體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)的多能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPS細(xì)胞)這一過程中發(fā)揮重要作用。本研究旨在克隆山羊klf4基因，構(gòu)建其原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)并純化His-klf4融合蛋白。[方法]從6周齡胎山羊生殖脊中提取總RNA，用RT-PCR的方法擴(kuò)增KLF4基因編碼區(qū)序列，通過TA克隆構(gòu)建pMD18-T-klf4質(zhì)粒。酶切鑒定與測序

2、分析后將klf4cDNA亞克隆至pET30a載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a-klf4。酶切鑒定后將其導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)其表達(dá)，SDS-PAGE和Western Blot檢測確認(rèn)，鎳離子金屬螯合親和層析法純化His-klf4融合蛋白。[結(jié)果](1)從山羊胎兒生殖脊中克隆了klf4基因；序列分析表明，klf4開放閱讀框由1434個氨基酸構(gòu)成，共編碼478個氨基酸：序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，其與綿羊的同源性最高，達(dá)到98.5