綿羊POU5F1、SOX2、KLF4和MYC基因的克隆、序列特征及其在睪丸中的表達(dá)分析研究.pdf

1、【目的】
　?、膨?yàn)證POU5F1(POU domain, class5, transcription factor1)、SOX2[SRY(sex determining region Y)-box2]、KLF4[Kruppel-like factor4(gut)]和 MYC(myelocytomatosis oncogene)基因在綿羊睪丸組織中的表達(dá)方式并克隆表達(dá)的mRNA序列。構(gòu)建攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞

2、表達(dá)載體，為將來(lái)獲得綿羊 Leydig細(xì)胞源誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（inducedpluripotent stem cell,iPSC）系提供物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　⑵用HSD3B染色方法確定成年小鼠Leydig細(xì)胞的體外生長(zhǎng)形態(tài)特征，為更好地鑒別體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細(xì)胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。
　　【方法】
　　⑴互補(bǔ)DNA模板來(lái)源于1周齡和6月齡大的湖羊的睪丸組織，通過(guò)RT-PCR和測(cè)序分別驗(yàn)證了POU5F1、SOX2、KLF4和M

3、YC基因在綿羊睪丸中的表達(dá)方式以及分別對(duì)表達(dá)的mRNA進(jìn)行分子克隆。
　　⑵基因組模板來(lái)自培養(yǎng)的30-40妊娠日齡的蒙古綿羊的胎兒成纖維細(xì)胞，通過(guò)PCR和測(cè)序驗(yàn)證綿羊KLF4的基因組序列。
　　⑶構(gòu)建4個(gè)攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體，分別為pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMXs-oKLF4和pMXs-oMYC質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶酶切法和測(cè)序法驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒序列的正確性。
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4、將參照組的pMXs-GFP質(zhì)粒和構(gòu)建的4個(gè)質(zhì)粒運(yùn)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染入Phoenix Amphotropic細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，在熒光條件下觀察pMXs-GFP的轉(zhuǎn)染效果，并對(duì)培養(yǎng)的新生綿羊的Leydig細(xì)胞進(jìn)行感染。細(xì)胞感染4 d后，在熒光條件下觀察pMXs-GFP質(zhì)粒對(duì)綿羊Leydig細(xì)胞的感染效果，并用RT-PCR法驗(yàn)證這4個(gè)質(zhì)粒攜帶基因的外源表達(dá)情況。⑹2月齡大的小鼠睪丸，剝離白膜后，用膠原酶消化獲得Leydig

5、細(xì)胞。Leydig細(xì)胞通過(guò)HSD3B染色方法鑒定。
　　【結(jié)果】
　?、臥OU5F1在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達(dá)。綿羊POU5F1的mRNA包含了一個(gè)1080 bp的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼了359個(gè)氨基酸。綿羊POU5F1含有1個(gè)POU結(jié)構(gòu)域和1個(gè)homeobox結(jié)構(gòu)域。綿羊POU5F1蛋白第206位的賴氨酸和第207位的纈氨酸的序列是物種特異的，其它的哺乳動(dòng)物在此對(duì)應(yīng)的賴氨酸

6、和纈氨酸位點(diǎn)之間還有一個(gè)色氨酸。
　?、芐OX2在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達(dá)。綿羊SOX2的mRNA含有一個(gè)963 bp的ORF，編碼了320個(gè)氨基酸。綿羊SOX2含有1個(gè)HMG(high mobility group)結(jié)構(gòu)域。
　　⑶MYC在新生的綿羊睪丸中表達(dá)。綿羊MYC的mRNA包含了一個(gè)1320 bp的ORF，編碼了439個(gè)氨基酸。綿羊MYC含有1個(gè) HLH（helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)域。
　

7、?、染d羊KLF4基因組從起始密碼子到終止密碼子的序列長(zhǎng)度為3159 bp，含有一個(gè)1434 bp的ORF，編碼了477個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。綿羊KLF4基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。綿羊KLF4蛋白在肽鏈的碳端有3個(gè)C2H2(cysteine2/histidine2)型的鋅指。POU5F1、SOX2、KLF4和MYC氨基酸序列分析表明綿羊與牛有著最近的進(jìn)化關(guān)系，與靈長(zhǎng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)有著相對(duì)較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系。SOX2和KLF4蛋白的氨基酸序列在綿

8、羊和牛中是100％的一致。
　?、上拗菩詢?nèi)切酶酶切法和測(cè)序法驗(yàn)證了構(gòu)建的pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMXs-oKLF4和pMXs-oMYC質(zhì)粒序列的正確性。通過(guò)用pMXs-GFP質(zhì)粒做對(duì)照，預(yù)測(cè)這4個(gè)構(gòu)建的質(zhì)粒能夠在AMPHO細(xì)胞系中有效地轉(zhuǎn)染。RT-PCR結(jié)果表明，這4個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒攜帶的外源基因均能夠在綿羊Leydig細(xì)胞基因組中整合并轉(zhuǎn)錄。
　?、蔋SD3B染色鑒定后表明，培養(yǎng)48 h的成年小鼠

9、Leydig細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下能夠清晰地分辨出Leydig細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。Leydig細(xì)胞的細(xì)胞核大而圓；細(xì)胞質(zhì)布滿了致密的脂滴，細(xì)胞質(zhì)折光性強(qiáng)。Leydig細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞充分伸展，形態(tài)多樣。一些細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，一些細(xì)胞單獨(dú)生長(zhǎng)。聚集生長(zhǎng)的各個(gè)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞的觸角
　　【目的】
　?、膨?yàn)證POU5F1(POU domain, class5, transcription factor1)、SOX2[SRY(sex

10、determining region Y)-box2]、KLF4[Kruppel-like factor4(gut)]和 MYC(myelocytomatosis oncogene)基因在綿羊睪丸組織中的表達(dá)方式并克隆表達(dá)的 mRNA序列。構(gòu)建攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體，為將來(lái)獲得綿羊 Leydig細(xì)胞源誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞（ induced pluripotent stem cell,iPSC）系提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

11、
　　⑵用HSD3B染色方法確定成年小鼠Leydig細(xì)胞的體外生長(zhǎng)形態(tài)特征，為更好地鑒別體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細(xì)胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。
　　【方法】
　?、呕パa(bǔ)DNA模板來(lái)源于1周齡和6月齡大的湖羊的睪丸組織，通過(guò)RT-PCR和測(cè)序分別驗(yàn)證了POU5F1、SOX2、KLF4和MYC基因在綿羊睪丸中的表達(dá)方式以及分別對(duì)表達(dá)的mRNA進(jìn)行分子克隆。
　?、苹蚪M模板來(lái)自培養(yǎng)的30-40妊娠日齡的蒙古綿羊的胎兒成纖維細(xì)胞

12、，通過(guò)PCR和測(cè)序驗(yàn)證綿羊KLF4的基因組序列。
　　⑶構(gòu)建4個(gè)攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體，分別為pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMXs-oKLF4和pMXs-oMYC質(zhì)粒。用限制性內(nèi)切酶酶切法和測(cè)序法驗(yàn)證構(gòu)建質(zhì)粒序列的正確性。
　?、葘⒄战M的pMXs-GFP質(zhì)粒和構(gòu)建的4個(gè)質(zhì)粒運(yùn)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染入Phoenix Amphotropic細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后，在

13、熒光條件下觀察pMXs-GFP的轉(zhuǎn)染效果，并對(duì)培養(yǎng)的新生綿羊的Leydig細(xì)胞進(jìn)行感染。細(xì)胞感染4 d后，在熒光條件下觀察pMXs-GFP質(zhì)粒對(duì)綿羊Leydig細(xì)胞的感染效果，并用RT-PCR法驗(yàn)證這4個(gè)質(zhì)粒攜帶基因的外源表達(dá)情況。
　　⑸2月齡大的小鼠睪丸，剝離白膜后，用膠原酶消化獲得Leydig細(xì)胞。Leydig細(xì)胞通過(guò)HSD3B染色方法鑒定。
　　【結(jié)果】
　?、臥OU5F1在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達(dá)。綿

14、羊POU5F1的mRNA包含了一個(gè)1080 bp的開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼了359個(gè)氨基酸。綿羊POU5F1含有1個(gè)POU結(jié)構(gòu)域和1個(gè)homeobox結(jié)構(gòu)域。綿羊POU5F1蛋白第206位的賴氨酸和第207位的纈氨酸的序列是物種特異的，其它的哺乳動(dòng)物在此對(duì)應(yīng)的賴氨酸和纈氨酸位點(diǎn)之間還有一個(gè)色氨酸。
　?、芐OX2在新生的和性成熟的湖羊睪丸中均表達(dá)。綿羊SOX2的mRNA含有一個(gè)963 bp的

15、ORF，編碼了320個(gè)氨基酸。綿羊SOX2含有1個(gè)HMG(high mobility group)結(jié)構(gòu)域。
　　⑶MYC在新生的綿羊睪丸中表達(dá)。綿羊MYC的mRNA包含了一個(gè)1320 bp的 ORF，編碼了439個(gè)氨基酸。綿羊MYC含有1個(gè) HLH（helix-loop-helix）結(jié)構(gòu)域。
　　⑷綿羊KLF4基因組從起始密碼子到終止密碼子的序列長(zhǎng)度為3159 bp，含有一個(gè)1434 bp的ORF，編碼了477個(gè)氨基酸的蛋白

16、質(zhì)。綿羊KLF4基因含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。綿羊KLF4蛋白在肽鏈的碳端有3個(gè)C2H2(cysteine2/histidine2)型的鋅指。POU5F1、SOX2、KLF4和MYC氨基酸序列分析表明綿羊與牛有著最近的進(jìn)化關(guān)系，與靈長(zhǎng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)有著相對(duì)較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系。SOX2和KLF4蛋白的氨基酸序列在綿羊和牛中是100%的一致。
　?、上拗菩詢?nèi)切酶酶切法和測(cè)序法驗(yàn)證了構(gòu)建的pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMX

17、s-oKLF4和pMXs-oMYC質(zhì)粒序列的正確性。通過(guò)用pMXs-GFP質(zhì)粒做對(duì)照，預(yù)測(cè)這4個(gè)構(gòu)建的質(zhì)粒能夠在AMPHO細(xì)胞系中有效地轉(zhuǎn)染。RT-PCR結(jié)果表明，這4個(gè)逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒攜帶的外源基因均能夠在綿羊 Leydig細(xì)胞基因組中整合并轉(zhuǎn)錄。
　?、蔋SD3B染色鑒定后表明，培養(yǎng)48 h的成年小鼠Leydig細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下能夠清晰地分辨出Leydig細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。Leydig細(xì)胞的細(xì)胞核大而圓；細(xì)胞質(zhì)布滿了致密

18、的脂滴，細(xì)胞質(zhì)折光性強(qiáng)。Leydig細(xì)胞培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞充分伸展，形態(tài)多樣。一些細(xì)胞聚集生長(zhǎng)，一些細(xì)胞單獨(dú)生長(zhǎng)。聚集生長(zhǎng)的各個(gè)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞的觸角（cellular tentacles）相互聯(lián)系，形成了表皮樣的外貌。RT-PCR結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)5 d的Leydig細(xì)胞能夠表達(dá)Leydig細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄，包括HSD3B6、CYP17A1和StAR。
　　【結(jié)論】新生湖羊的睪丸組織能夠表達(dá)POU5F1、SOX2和MYC基因，但不表達(dá)

19、KLF4基因。獲得了綿羊POU5F1、SOX2和MYC基因的編碼區(qū)的mRNA序列，以及獲得了蒙古綿羊KLF4的基因組序列。構(gòu)建了有效的攜帶綿羊重編程因子基因序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因傳遞表達(dá)載體，分別為pMXs-oPOU5F1、pMXs-oSOX2、pMXs-oKLF4和pMXs-oMYC。鑒定了體外培養(yǎng)的成年小鼠Leydig細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)特征，為將來(lái)更好地鑒定體外培養(yǎng)的綿羊Leydig細(xì)胞提供技術(shù)基礎(chǔ)。這些研究結(jié)果可為將來(lái)獲得綿羊Leydi