銀杏內(nèi)酯B促進缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細胞-巨噬細胞向M2亞型極化及其機制研究.pdf

1、腦卒中是目前人類健康的第二大殺手，嚴重威脅了人類健康。在腦卒中中，缺血性腦卒中約占85％，在我國已成為第一致死性疾病。目前的研究表明腦卒中的病理機制主要有:氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙、興奮性毒性以及神經(jīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)。這些病理變化共同導(dǎo)致了神經(jīng)細胞的死亡，造成了嚴重的神經(jīng)損傷。雖然對于缺血性腦卒中的病理機制目前已經(jīng)有了一定程度的認識，然而針對腦卒中的治療藥物依然局限于重組組織纖維溶酶原激活劑(Recombinant tissueplasmi

2、nogen activator，r-tPA)。由于r-tPA的治療時間窗窄，不良反應(yīng)嚴重，因此尋找其他腦卒中治療藥物并研究其作用機制對于腦卒中的治療與保護是研究者亟待解決的重點課題。
　　在腦卒中發(fā)生后，“瀑布樣”的神經(jīng)炎性級聯(lián)反應(yīng)對于神經(jīng)元的存亡起到了關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)的主要是腦中的小膠質(zhì)細胞和因血-腦屏障(BBB)破壞而浸潤到中樞的外周巨噬細胞。這些小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞將通過參與和調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥從而影響腦卒中后神經(jīng)

3、元的命運和腦組織的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)。例如:通過經(jīng)典激活途徑極化成M1亞型的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞具有促炎作用，加重中樞炎癥反應(yīng);通過選擇性激活途徑極化成M2亞型的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞能發(fā)揮抗炎及保護作用，對抗中樞炎癥并參與組織修復(fù)。由此可見，小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的極性對腦卒中的病理進程起到了重要的調(diào)節(jié)作用，尤其在腦卒中的恢復(fù)期，炎性的M1型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞將在數(shù)量上占優(yōu)勢，不利于卒中后的損傷修復(fù)。因此，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的極性，作為一

4、個全新的治療策略，在近年越來越受到腦卒中研究者的關(guān)注。
　　銀杏內(nèi)酯B是銀杏葉提取物的重要活性成分，并因其為天然最強的血小板激活因子受體(Platelet Activator Factor Receptor，PAF receptor)的拮抗劑而受到廣泛地關(guān)注。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)中都發(fā)揮神經(jīng)保護作用，但作用機制目前尚不明確。因此，進一步挖掘銀杏內(nèi)酯B的藥理作用與機制，將有利于加深我們對銀杏內(nèi)酯B—這一重要

5、神經(jīng)保護劑的認識。
　　本文首先建立小鼠tMCAO模型研究銀杏內(nèi)酯B對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護作用，在此基礎(chǔ)上，結(jié)合離體細胞實驗，確證了銀杏內(nèi)酯B對小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)作用。之后，通過在體外誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞株極化成不同極性，探究銀杏內(nèi)酯B調(diào)節(jié)極化的作用機制，發(fā)現(xiàn)其與抑制血小板激活因子受體有關(guān)。本研究驗證了銀杏內(nèi)酯B對腦卒中tMCAO模型的神經(jīng)保護作用，闡明了其通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化發(fā)揮神經(jīng)保護作用，而且探究了其

6、機制與可能拮抗PAF受體有關(guān)，揭示了銀杏內(nèi)酯B新的藥理作用，提示銀杏內(nèi)酯B可以用于治療其他小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化相關(guān)疾病。
　　目的:
　　研究銀杏內(nèi)酯B對小鼠缺血性腦卒中后的神經(jīng)保護作用以及對小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)作用與機制。
　　方法:
　　1)選用月齡2～3個月的C57BL/6J小鼠，使用線栓法制備大腦中動脈阻塞（transient Middle Cerebral Artery Occlusion

7、，tMCAO）模型，缺血1h后再灌，于再灌后1h給與不同劑量的銀杏內(nèi)酯B注射液（1.75 mg/kg，3.5 mg/kg，7.0mg/kg)，腹腔注射給藥，一天兩次，持續(xù)3天。3天后，對小鼠進行神經(jīng)功能學(xué)評分，并處死取腦。測定腦梗死體積及腦組織含水量，從而研究銀杏內(nèi)酯B治療缺血性腦卒中的有效劑量。
　　2)選擇銀杏內(nèi)酯B(3.5 mg/kg，ip，bid，3d&7d)于腦缺血1h再灌給藥，應(yīng)用免疫熒光實驗觀察銀杏內(nèi)酯B對缺血性腦卒

8、中后缺血半影區(qū)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的極化是否有調(diào)節(jié)作用;同時取治療3天及7天的腦組織，進行勻漿處理，利用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒對極化相關(guān)因子:M1相關(guān)細胞因子(TNF-α、IL-6)及M2相關(guān)細胞因子(TGF-β、IL-10)進行檢測。此外，采用Real-time PCR研究銀杏內(nèi)酯B對tMCAO造模后腦組織中極化相關(guān)因子（iNOS、CCL2、TNF-α、C

9、D206、Ym1和Arg1）mRNA水平的調(diào)節(jié)作用。利用以上三種實驗手段研究銀杏內(nèi)酯B對tMCAO腦缺血模型后小鼠大腦半影區(qū)小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)作用。
　　3)培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞系BV2細胞和小鼠骨髓源性巨噬細胞，在離體上通過給予LPS+IFN-γ或IL-4極化誘導(dǎo)物及銀杏內(nèi)酯B(1μM)，在體外驗證GB對小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)作用。利用ELISA和Real-time PCR檢測GB對釋放的細胞因子蛋白和mRNA水平

10、的調(diào)節(jié)作用。
　　4)另外，在小膠質(zhì)細胞上，利用流式細胞術(shù)(Flow-cytometry，F(xiàn)C)檢測不同亞型標志性的趨化因子蛋白的表達，從而鑒定銀杏內(nèi)酯B對極化的調(diào)節(jié)作
　　5)培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞系BV2細胞，在離體上通過給予LPS+IFN-γ先將BV2細胞誘導(dǎo)成M1型再給與M2型誘導(dǎo)物IL-4，觀察銀杏內(nèi)酯B（1μM）對小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化的調(diào)節(jié)作用;再給與PAF受體拮抗劑CV3988（10μM），對比GB對小膠質(zhì)細胞/巨

11、噬細胞極化的調(diào)節(jié)作用的改變。
　　6)利用靶向于PAF受體的siRNA干擾PAF受體的表達，利用WesternBlotting法檢測干擾效率。
　　7)利用流式細胞術(shù)、ELISA、Real-time-PCR檢測BV2細胞極性的變化，探究拮抗PAF受體是否為GB調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化作用的機制。
　　結(jié)果:
　　1)使用銀杏內(nèi)酯B(3.5 mg/kg，7.0 mg/kg)對tMCAO缺血三天小鼠具有神經(jīng)保護作用。GB可

12、顯著減少tMCAO引起的小鼠的腦梗死體積，緩解腦水腫程度，并改善神經(jīng)功能學(xué)評分。其中3.5 mg/kg是最小有效劑量，因此在后續(xù)實驗中使用3.5 mg/kg進行給藥。
　　2)tMCAO術(shù)后3天及7天，銀杏內(nèi)酯B均可以促進小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞向M2型極化。免疫熒光實驗結(jié)果顯示GB可促進M2型小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞表面趨化因子CD206的表達并減少M1型趨化因子CD16/32的表達;同時利用ELISA和real-timePCR檢測腦組

13、織中M1/2亞型相關(guān)炎癥因子，發(fā)現(xiàn)GB可以增加M2相關(guān)因子的表達和釋放并抑制M1亞型相關(guān)因子的產(chǎn)生和釋放。
　　3)先將小膠質(zhì)細胞株BV2和骨髓源性巨噬細胞誘導(dǎo)成M1亞型，再給予GB和M2亞型的誘導(dǎo)物，GB能夠顯著促進以上兩種細胞向M2型極化。
　　4)使用CV3988（10μM），得到和GB相似的極化調(diào)節(jié)作用，提示GB對極化的調(diào)節(jié)作用可能涉及對PAF受體的拮抗作用。
　　5)通過使用siRNA干擾PAF受體的表達，驗

14、證拮抗PAF受體為GB調(diào)節(jié)極化的機制。
　　結(jié)論:
　　1)GB能夠促進小鼠缺血性腦卒中后的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞向M2型極化并發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　2)拮抗PAF受體為GB調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化的可能機制。
　　綜上所述，本文的主要創(chuàng)新之處在于:
　　1)GB通過調(diào)節(jié)缺血性腦卒中后小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞極化發(fā)揮神經(jīng)保護作用
　　GB能夠顯著減輕小鼠腦缺血再灌注所致的神經(jīng)運動障礙、腦水腫程度以及減少腦組織梗

15、死體積。并促進缺血性腦卒中后的小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞向M2型極化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
　　2)GB通過拮抗PAF受體調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化
　　GB是自然界最強的PAF受體拮抗劑，通過藥理學(xué)實驗和siRNA干擾技術(shù)，闡明了拮抗PAF受體為GB調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞極化的可能機制，揭示了PAF受體在調(diào)控小膠質(zhì)細胞生物學(xué)特性中的重要作用。
　　本研究闡明了GB的新的藥理機制，揭示了其發(fā)揮腦缺血保護作用的可能機制，提示了GB用于治療其