PTX3通過促進M2型巨噬細胞的分化減輕糖尿病腎病的腎損傷.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行論述：
　　第一部分 PTX3能夠減輕糖尿病腎病的腎損傷
　　目的：
　　DN的發(fā)病機制尚不明確，高血糖、高血脂、高血壓等多種因素參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展，這些因素誘導多種炎性介質分泌，促進炎性細胞聚集導致DN出現(xiàn)免疫損傷，因此免疫系統(tǒng)激活和微炎癥狀態(tài)是目前較一致認可的DN發(fā)病機制。
　　正五聚蛋白3(PTX3)是一種與C-反應蛋白(CRP)和血清淀粉樣蛋白A(SAP)同屬于正五聚蛋白超

2、家族的急性炎癥蛋白，由多種炎癥免疫細胞如中性粒細胞、巨噬細胞、樹突樣細胞和內皮細胞等分泌或合成。Lech M等研究發(fā)現(xiàn)，內源性或外源性PTX3能夠減輕小鼠缺血再灌注后的急慢性腎損傷?；谏鲜霰尘?，本研究第一部分探討PTX3是否具有減輕糖尿病腎病的腎損傷作用。
　　方法：
　　1.糖尿病腎病(DN)模型的建立
　　24只8-12周齡雄性C57BL/6小鼠，6只正常飼養(yǎng)小鼠為正常對照組(NC組)。18只小鼠腹腔注射鏈脲佐菌

3、素STZ(50mg/kg)連續(xù)5天，定期檢測血糖和尿蛋白。STZ注射4周后經(jīng)化驗證實DN小鼠模型建模成功，進行干預分組，分為三組，PTX3組(n=6)，DN小鼠建模成功后腹腔注射Recombinant PTX3(0.5mg/kg)，每日一次，共注射4周;Anti-PTX3組(n=6)，為中和內源性PTX3，建模成功后腹腔注射抗鼠PTX3單克隆抗體(anti-mouse PTX3mAb，0.2mg/kg)每日一次，共注射4周;Contro

4、l組(n=6)為糖尿病腎病小鼠對照組，腹腔注射同等劑量的緩沖液;干預4周（即STZ給藥8周）后處死所有小鼠，藥物干預前（STZ給藥4周）和干預后（STZ給藥8周）分別留取血樣檢測血肌酐和24小時尿液，測定小鼠尿微量白蛋白的水平。Western blot檢測正常對照組(NC組)和DN小鼠Control組腎組織內足細胞標記物Desmin和Nephrin的蛋白表達水平。
　　2.PTX3能夠減輕糖尿病腎病的腎損傷
　　18只DN小

5、鼠分為三組，PTX3組(n=6)，Anti-PTX3組(n=6)和Control組(n=6)，用免疫組化法檢測Desmin在三組小鼠腎組織中的表達，Western blot檢測三組腎組織Nephrin和WT-1的蛋白水平。應用流式細胞術(FCM)檢測三組腎組織中炎性細胞包括CD4+T細胞、CD8+T細胞、Ly6G+中性粒細胞和CD11b+巨噬細胞的數(shù)目。Western blot檢測三組腎組織炎癥因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-4和

6、IL-13的表達水平。
　　結果：
　　1.STZ注射4周后糖尿病腎病模型組（Control組）血糖和尿微量白蛋白水平明顯高于正常對照組(NC組)(P＜0.05)，Control組足細胞損傷標記物Desmin蛋白表達水平顯著高于NC組，而正常足細胞標記物Nephrin的蛋白水平顯著低于NC組(P＜0.05)，說明糖尿病腎病小鼠模型成功建立。
　　2.通過對DN小鼠三組（PTX3組、Anti-PTX3組、Control組

7、）實驗結果的比較發(fā)現(xiàn)，PTX3干預糖尿病腎病小鼠4周后，尿微量白蛋白定量明顯低于干預前(P＜0.05)，在同期對照比較中，PTX3組尿微量白蛋白定量明顯低于Control組(P＜0.05);Desmin在PTX3組小鼠腎組織中的表達減少，Nephrin和WT-1的蛋白水平顯著高于Control組(P＜0.05)，而Anti-PTX3組則顯示出相反的結果，加重了DN的腎損傷。
　　3.PTX3組腎組織中浸潤的炎性細胞包括CD4+T細

8、胞、CD8+T細胞、Ly6G+中性粒細胞和CD11b+巨噬細胞的數(shù)目明顯少于Control組(P＜0.05)，PTX3能夠上調抑炎性因子IL-4和IL-13，下調促炎性因子IFN-γ、TNF-α的表達(P＜0.05)，說明PTX3能夠抑制促炎性免疫反應。
　　結論：
　　1.PTX3可以降低STZ誘導的糖尿病腎病小鼠尿微量白蛋白定量，具有穩(wěn)定足細胞結構、減少足細胞損傷的作用，從而減輕糖尿病腎病的腎損傷。
　　2.PTX

9、3能夠減少糖尿病腎病小鼠腎組織中炎性細胞浸潤，上調抑炎性因子IL-4和IL-13，下調促炎性細胞因子IFN-γ、TNF-α的表達，減輕腎組織的炎性損傷。
　　第二部分 PTX3促進巨噬細胞向M2型分化
　　目的：
　　糖尿病腎病的發(fā)病機制尚不明確，高血糖、高血脂、高血壓等多種因素參與糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展，這些因素誘導多種炎性介質分泌，促進炎性細胞聚集導致DN出現(xiàn)免疫損傷。因此多種炎癥因子和免疫細胞參與DN的免疫損傷，

10、這是目前一致認可的DN發(fā)病機制。DN早期，巨噬細胞作為最主要的炎性細胞浸潤在腎小球和腎間質中，由于具有極強的異質性，能夠在不同環(huán)境誘導下分化為不同表型的亞群，從而發(fā)揮不同的功能。Th1細胞因子IFN-γ、 TNF-α可以刺激巨噬細胞向M1型分化（經(jīng)典活化型），M1主要表達iNOS、CD16/32、IL-12及TNF-a等促炎因子，主要發(fā)揮抗原提呈和免疫炎癥作用。Th2分泌IL-4和IL-13可以誘導巨噬細胞向M2型分化（替代活化型），M

11、2高表達CD206、Arg-1及IL-10等分子，表現(xiàn)為抗炎活性，有很強的組織修復能力。臨床及動物實驗均顯示在糖尿病組織損傷部位存在以M1型巨噬細胞為主。在一定條件下，M1和M2亞型可相互轉換。
　　第一部分實驗結果顯示PTX3能夠減少活性炎性細胞的浸潤，下調促炎性因子IFN-γ、 TNF-α和上調抑炎性因子IL-4和IL-13的表達，從而減少腎臟促炎性免疫反應，減輕糖尿病腎病的腎損傷。而IL-4和IL-13可以誘導巨噬細胞向M2

12、型分化，推測PTX3可能具有調節(jié)巨噬細胞M1/M2動態(tài)平衡，促進巨噬細胞向M2型分化，減少炎癥損傷的功能。因此本研究第二部分通過體內和體外實驗研究PTX3是否能夠抑制M1型巨噬細胞表達，促進巨噬細胞向M2型轉化，進一步說明PTX3通過促進M2型巨噬細胞的分化減輕糖尿病腎病的腎損傷。
　　方法：
　　1.為研究PTX3是否影響巨噬細胞的極化作用，分別從DN小鼠模型和體外RAW264.7細胞培養(yǎng)進行研究。利用本研究第一部分中三組

13、DN小鼠（Control組、PTX3組和Anti-PTX3組）的腎臟取材標本，Western blot檢測M1型巨噬細胞表型標記物iNOS、CD16/32和M2型巨噬細胞表型標記物CD206、Arg-1蛋白水平的變化，流式細胞術（Flow Cytometry, FCM）檢測M1型和M2型巨噬細胞的數(shù)目。
　　2.小鼠單核巨噬細胞株RAW264.7用RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，含10 ％FBS、青霉素100u/mL和鏈霉素100u

14、/mL。采用高糖（右旋葡萄糖）濃度依賴性(11.1mM，20mM，30mM，35mM)以及時間依賴性(Oh，6h，12h，24h，48h)刺激RAW264.7細胞株。用酶活性法檢測巨噬細胞活化表型標志物iNOS的活性。Recombinant PTX3 (200ng/ml)干預高糖(30mM)組RAW264.7細胞，預孵育12小時，Trizol法提取細胞RNA，采用RT-PCR技術檢測M1型巨噬細胞表型標記物iNOS、CD16/32和M2

15、型巨噬細胞表型標記物CD206、Arg-1 mRNA的變化。
　　結果：
　　1.與DN小鼠Control組相比，M1型巨噬細胞表型標記物iNOS、CD16/32的蛋白水平在PTX3組中表達明顯增多而M2型標記物CD206、Arg-1蛋白水平則顯著減少(P＜0.05)，通過流式細胞術檢測M1型和M2型巨噬細胞的數(shù)目發(fā)現(xiàn)，PTX3組M2型巨噬細胞的數(shù)目明顯多于M1型(P＜0.05)，而Anti-PTX3組則顯示出相反的結果，說

16、明PTX3可以促使DN小鼠腎組織的巨噬細胞由M1型向M2型轉化。
　　2.高糖環(huán)境下能夠刺激RAW264.7的iNOS活性增強，呈濃度依賴性上升。其中，30mM高糖組刺激RAW264.7表達iNOS活性達最大值(48.1±6.6 U/mgprot，P＜0.05)。高糖時間依賴性刺激RAW264.7，高糖組從0至12h產(chǎn)生iNOS活性隨時間延長表達逐漸增加，呈時間依賴性。高糖刺激RAW264.7達12h時iNOS活性達最大值(44.

17、6±10.7 U/mgprot，P＜0.05)。高糖(30mM，12h)刺激M1型標記物iNOS、CD16/32 mRNA表達增加(P＜0.05)，M2型標記物CD206、Arg-1 mRNA表達下降(P＜0.05)。高糖(30mM)+ PTX3干預后，M1型標記物iNOS、CD16/32mRNA表達下降(P＜0.05)，M2型標記物CD206、Arg-1 mRNA表達增加(P＜0.05)，說明高糖環(huán)境可以促使巨噬細胞向M1型活化，PT