FABP4通過內質網應激介導糖尿病腎病中系膜細胞的凋亡.pdf

1、目的：糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetesmellitus，DM)最常見的并發(fā)癥之一，也是目前我國乃至世界導致終末期腎病的一個主要原因。它的主要病理改變是系膜基質增生、腎小球和腎小管基底膜增厚、細胞外基質積聚，最終出現(xiàn)腎小球硬化、腎小管萎縮和間質纖維化。越來愈多的研究表明腎臟固有細胞的凋亡在DN的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。脂質在腎小球或腎小管上皮細胞內沉積是包括DN在內的許多腎臟疾病的常見

2、的病理變化，脂質沉積造成細胞功能受損即所謂的“脂毒性”。但脂質引起細胞損傷的機制尚不清楚。游離脂肪酸(Free fattyacids，F(xiàn)FAs)，又稱非酯化脂肪酸，在循環(huán)血液中與白蛋白結合，DN患者血液中其含量明顯高于正常人。DN早期由于腎小球超過濾，F(xiàn)FAs隨白蛋白通過腎小球濾過膜進入腎組織。FFAs不僅沉積在腎小球，也通過重吸收沉積在腎小管上皮細胞。脂肪型脂肪酸結合蛋白(adipocyte fatty acidbinding pro

3、tein，A-FABP/FABP4/aP2)是脂肪酸結合蛋白家族中最具特征的成員，作為FFAs的分子伴侶蛋白，通過與脂肪酸結合，促進FFAs的轉運，其表達量與FFAs的含量密切相關。但在腎組織的表達和意義尚未見報道。
　　內質網(endoplasmic reticulum，ER)是脂質合成、蛋白質折疊和成熟的重要細胞器，Ca+的耗竭、缺血、缺氧、錯誤折疊及未折疊蛋白在腔內的聚集均可影響ER的功能，繼而誘發(fā)內質網應激(endopla

4、smic reticulumstress，ERS)。ERS將激活體內的未折疊蛋白反應(unfolded proteinresponse，UPR)，持續(xù)的UPR最終將導致細胞凋亡。雖然已經證實DN存在ERS，但很多機制尚不完全清楚。
　　我們前期的研究結果證明：1型DM大鼠早期血清FFAs水平升高，DM大鼠早期腎皮質FABP4的表達上調。本研究進一步觀察人DN腎組織中FABP4的表達變化，同時檢測ERS相關蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2

5、的表達；試圖探討FABP4與ERS之間的關系。
　　本研究分為二部分：1、人腎活檢標本的研究：采用免疫組織化學方法檢測45例DN腎活檢組織中FABP4分布和表達，同時檢測GRP78、Caspase-12和Bcl-2的表達；并定量分析上述指標在腎小球中的表達變化；2、細胞學研究：給予人腎小球系膜細胞(Human mesangial cell，HMC)高糖和不同濃度的油酸(Oleic acids，OA)進行干預，觀察HMC的超微形態(tài)學

6、變化，并檢測HMC中FABP4、GRP78、Caspase-12表達變化。
　　方法：
　　1人DN腎組織中FABP4、GRP78、Caspase-12和Bcl-2的分布、定位和定量分析
　　收集經病理證實的DN腎活檢標本45例作為病變組(DN組)，同時收集10例微小病變型腎病(minimal change glomerulonephropathy，MCGN)腎活檢標本作對照組。HE、PAS染色進行形態(tài)學觀察；免疫組化

7、的方法檢測兩組腎活檢組織中FABP4及GRP78、Caspase-12和Bcl-2的表達，應用Image-Pro-Plus5.0軟件進行腎小球上述指標定量分析，取統(tǒng)一放大倍數下DN組和MCGN組所有切片的腎小球進行定量(完全硬化的腎小球剔除)。
　　2 HMC系在高糖和高OA條件下的的超微形態(tài)學變化和FABP4及GRP78、GADD153/CHOP、Caspase-12的表達特征分析
　　將分化成熟的系膜細胞分為5組：正常對

8、照組，高糖培養(yǎng)組(30mmol/1)和OA培養(yǎng)組(濃度分別為100μmol/1、200μmol/1、400μmol/1)。細胞同步化后進行分組干預，分別于干預24、48h后收集各組細胞，掃描電鏡和透射電鏡觀察細胞超微結構改變；免疫細胞化學和Western Blot檢測細胞中FABP4、GRP78、GADD153/CHOP和Caspase-12的表達。
　　結果：
　　1人腎活檢結果分析
　?、貲N組的組織病理學分析

9、r>　　45例DN組腎活檢組織中，既有早期的變化如：腎小球肥大，彌漫性系膜基質增生、腎小球基底膜增厚，部分腎小囊內可見腎小囊滴，腎小球毛細血管袢可見纖維素帽狀病變；腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡和顆粒變性，腎小管基底膜增厚；又有晚期的病理改變如彌漫性腎小球硬化及結節(jié)性硬化，結節(jié)性硬化可見典型的Kimmelstiel Wilson結節(jié)，呈局灶型分布。隨著病變進展逐漸出現(xiàn)腎小管萎縮、腎間質炎癥細胞浸潤和間質纖維化，小動脈管壁增厚、玻璃樣變及管腔狹窄

10、。
　?、贔ABP4、GRP78、Caspase-12和Bcl-2的表達特征：免疫組織化學結果：MCGN組腎活檢組織FABP4在腎小球系膜細胞、個別毛細血管內皮細胞的胞漿和胞核表達；足細胞及腎小管上皮細胞未見陽性表達。DN組可見陽性表達FABP4的系膜細胞數量增多。GRP78在MCGN組主要表達于腎小管上皮細胞和血管內皮細胞胞漿內，部分腎小球系膜細胞和腎小囊壁層上皮細胞的胞漿也有表達。DN組GRP78表達于腎小管上皮細胞、血管內皮

11、細胞、系膜細胞及腎小囊壁層上皮細胞胞漿內，在腎間質炎細胞的胞漿中也有表達，且在系膜細胞和腎小囊壁層上皮細胞的表達量增加。Caspase-12在MCGN組表達于腎小管上皮細胞及血管平滑肌細胞胞漿，腎小球系膜細胞和腎小囊壁層上皮細胞胞漿亦有表達，在DN組其表達明顯增強。Bcl-2在MCGN組表達于腎小管上皮細胞、腎小囊壁層上皮細胞和部分腎小球系膜細胞的胞漿；在DN組腎間質的淋巴細胞胞漿可見到Bcl-2的陽性表達；系膜細胞和腎小囊壁層上皮細胞

12、的表達量減少。
　?、勰I小球中FABP4、GRP78、Caspase-12和Bcl-2表達的定量分析：DN組腎小球FABP4、GRP78和Caspase-12的表達均高于MCGN組(P＜0.05)，而Bcl-2的表達低于MCGN組(P＜0.05)。
　　2培養(yǎng)人系膜細胞系結果分析FABP4及ERS相關蛋白的表達和含量改變
　?、俨煌深A條件下HMC超微結構特點分析：掃描電鏡觀察，正常對照組HMC之間通過長長的偽足相互聯(lián)

13、系；與對照組相比，HG組系膜細胞體積增大，核仁明顯，亦由偽足相互連接，細胞表面出現(xiàn)分泌小泡；OA組HMC細胞明顯皺縮，體積縮小，偽足消失，細胞表面分泌小泡增多。
　　透射電鏡觀察，與對照組相比，HG組細胞胞漿內出現(xiàn)脂滴，線粒體腫脹，胞漿內出現(xiàn)自噬泡；與對照組相比OA組細胞表面微絨毛減少、脫落，細胞漿內脂滴增多，內質網和線粒體腫脹。
　?、诿庖呒毎瘜W結果：對照組系膜細胞，F(xiàn)ABP4表達量較少，HG、OA組與對照組相比，表達量

14、明顯增加，且OA組細胞皺縮，體積縮小，偽足消失。GRP78、GADD153/CHOP和Caspase-12在細胞的胞漿和胞核均有表達，對照組表達較弱，高糖及高OA刺激后表達明顯增強。
　　③Western Bolt結果：培養(yǎng)24h和48h的HMC，與對照組相比，HG組和OA組其FABP4、GRP78、GADD153/CHOP和Caspase-12表達均高于對照組；與刺激24h的HMC相比，HG和OA刺激48h的細胞FABP4表達量

15、下降，GRP78、GADD153/CHOP和Caspase-12表達量增加；OA組不同濃度間上述幾個指標的表達量未見差別。
　　結論：
　　1 DN患者腎活檢組織腎小球的FABP4、GRP78和Caspase-12表達增高，Bcl-2表達減少，說明①DN的腎小球系膜細胞FABP4的表達上調；②DN存在ERS；③DN持續(xù)的ERS抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進系膜細胞的凋亡。④我們的結果為DN腎小球硬化性病變提供實驗依據。