AP2-ERF轉錄因子調控丹參活性成分生物合成的功能研究.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge.)為我國常用大宗藥材，其有效成分——丹參酮和丹酚酸類化合物具有多種藥理活性，以丹參為君藥的“復方丹參滴丸”在治療心腦血管疾病方面已取得顯著療效。近年來，丹參活性成分生物合成途徑分子機制已獲得深入解析，但其生物合成的調控機制研究尚十分匱乏。AP2/ERF轉錄因子在多種藥用植物中具有調控活性成分（如倍半萜青蒿素、二萜紫杉醇等）生物合成的功能，而在丹參中調控活性成分合成的AP2/ERF

2、尚未報道。本次研究的主要研究結果如下：
　　1.本課題組已獲得丹參基因組圖譜，注釋到170個AP2/ERF轉錄因子，命名為Sm001-Sm170。本研究基于已有丹參不同器官（根、莖、葉、花）及根不同組織（周皮、韌皮部、木質部）的轉錄組數據，參照已鑒定參與丹參酮及丹酚酸類化合物生物合成關鍵酶基因的表達譜，篩選出兩個AP2/ERF轉錄因子，皮＜韌皮部和木質部的規(guī)律;Sm082具有在根中顯著性高豐度表達的特點。通過實時熒光定量PCR實驗

3、驗證這兩個AP2/ERF基因的表達譜，結果與轉錄組數據一致。構建瞬時轉化體系，侵染煙草葉片，分析Sm008和Sm082的亞細胞定位情況，證明兩個轉錄因子定位于細胞核中。
　　2.本研究構建了丹參遺傳轉化體系，對Sm008和Sm082進行過表達、RNAi抑制表達分析，獲取了丹參轉基因毛狀根。檢測陽性轉基因毛狀根中Sm008基因抑制表達和過表達的效率，篩選出3個抑制表達株系：8i-1/3/6;3個過表達株系：8oe-1/8/9。檢測了

4、轉基因毛狀根中丹酚酸類化合物的含量變化，每個株系做三個生物學重復。
　　結果表明，與對照組相比，3個抑制表達株系中丹酚酸B的含量有明顯下降，同時3個過表達株系中丹酚酸B含量明顯上升。另外，觀察到Sm008轉基因毛狀根和培養(yǎng)液呈現丹參酮類化合物所具有的黃/紅色，所以對丹參酮的含量變化進行檢測，結果發(fā)現，與對照組相比，Sm008抑制表達的2個株系中二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA的含量在毛狀根及培養(yǎng)液中均下降，說明Sm00

5、8基因可能對丹酚酸及丹參酮類化合物的生物合成均具有調控作用。進一步分析轉基因毛狀根中參與丹參酮和丹酚酸生物合成基因的表達量變化，預測轉錄因子可能調控的目的基因，結果表明，Sm008可能調控的丹酚酸途徑的目的基因為4CL2基因，丹參酮途徑的目的基因為CPS1、KSL1、CYP76AH1基因。
　　3.對于Sm082的轉基因株系，篩選出4個抑制表達株系：82i-1/5/7/19;1個過表達株系：82oe-9?；瘜W含量分析結果表明，與對

6、照組相比，4個抑制表達株系中二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA明顯下降，過表達株系中二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮含量上升;而丹酚酸B含量在過表達及RNAi株系中均無明顯變化;說明Sm082基因對丹參酮類化合物的生物合成具有調控作用，對丹酚酸類化合物的生物合成不具有調控作用。分析關鍵酶基因的表達量變化說明Sm082可能調控丹參酮途徑的目的基因為CPS1、KSL1基因。本次研究還獲得了Sm082轉基因毛狀根對應的轉基因組培苗，觀察根系及

7、葉片的熒光情況及qRT-PCR實驗證明轉基因組培苗依然攜帶GFP報告基因且保持了Sm082基因的抑制/過表達狀態(tài)。
　　4.構建Sm008和Sm082基因的原核表達體系，Sm008在異源表達體系中可以表達并獲得可溶性蛋白，而Sm082在蛋白提取的上清和沉淀中均未誘導表達獲得蛋白。同時，我們還預測了丹參酮及丹酚酸類化合物生物合成途徑中一系列關鍵酶基因的啟動子區(qū)，篩選出含有GCC box的啟動子序列并進行啟動子區(qū)克隆，已克隆到啟動子區(qū)