茉莉酸信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2調(diào)控丹參有效成分生物合成的功能解析.pdf

1、丹參Salvia miltiorrhiza Bunge為唇形科鼠尾草屬植物，載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，藥用部位為根及根莖，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效，臨床用于治療冠心病、心絞痛、缺血性腦卒中等疾病，其有效成分主要包括以丹參酮ⅡA為代表的脂溶性萜類化合物和以丹參酚酸B為主的水溶性酚酸類化合物。文獻(xiàn)報(bào)道，MeJA誘導(dǎo)處理可以使丹參酮ⅡA的含量提高4.5倍，丹參酚酸B的含量提高6倍。然而，MeJA促進(jìn)丹參酮ⅡA和丹參酚酸B生物合成的機(jī)制未得到闡明

2、。
　　我們通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的方法篩選出了受MeJA誘導(dǎo)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2a和SmMYC2b。SmMYC2a的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)1803個(gè)堿基，該ORF編碼了一個(gè)含有600個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì);SmMYC2b的ORF含1824個(gè)堿基，該ORF編碼了一個(gè)含有607個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果表明，SmMYC2a和SmMYC2b都含有bHLH結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH家族。此外，這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子還含有保守的JID結(jié)構(gòu)域，可能與J

3、AZ蛋白存在互作。
　　MeJA誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)表明，SmMYC2都早期響應(yīng)MeJA，在0.5 h的時(shí)候表達(dá)量最高。不同的是，MYC2a在0.5 h以后呈緩慢下降趨勢(shì)，而MYC2b則在1h就迅速下降到了基值，表明比起SmMYC2b，SmMYC2a可能具有更加廣泛的調(diào)節(jié)作用。
　　亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SmMYC2都定位在細(xì)胞核，符合轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核的基本特性。
　　為驗(yàn)證SmMYC2在體內(nèi)的功能，考察其是否能夠影響丹參酮

4、和丹參酚酸B的合成。構(gòu)建了MYC2-NAi的載體，C58C1農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化丹參發(fā)根。QRT-PCR的結(jié)果顯示，RNAi沉默SmMYC2 a/b后，丹參酮類合成途徑和丹參酚酸合成途徑的基因的表達(dá)與對(duì)照比均有顯著降低。除了共同調(diào)控基因CMK，CPS，TPS，PAL，RAS6和CYP98A14，SmMYC2a還影響了HMGR，MCS，GPPS，GGPPS和KSL的表達(dá)，SmMYC2b還影響了MK和DXR的表達(dá)。
　　含量測(cè)定結(jié)果表明

5、，在MYC2a-RNAi和MYC2b-RNAi的轉(zhuǎn)基因發(fā)根中，萜類化合物丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮、二氫丹參酮含量均有不同程度的降低，酚酸類化合物苯丙氨酸、尿黑酸、迭香酸、丹參酚酸A、丹參酚酸B的含量也有顯著降低。MYC2a的沉默使得丹參酮ⅡA的含量下降至對(duì)照的6.4％，丹參酚酸B下降至對(duì)照的23.2％;MYC2b的沉默使得丹參酮ⅡA的含量下降至對(duì)照的40.2％，丹參酚酸B下降至對(duì)照的5.0％。說(shuō)明MYC2a和MYC2b都是正調(diào)控的

6、轉(zhuǎn)錄因子，都對(duì)多個(gè)酶基因、多條合成途徑、多種化合物起到了調(diào)控作用，其調(diào)控結(jié)果是相似的。然而，其影響的關(guān)鍵基因是不完全相同的，表明這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控丹參有效成分生物合成的機(jī)制上存在差異，是不可替代的。
　　為了進(jìn)一步研究MYC2調(diào)控丹參酮和丹參酚酸生物合成的分子機(jī)制，擴(kuò)增了多個(gè)關(guān)鍵酶基因的啟動(dòng)子，篩選出包含MYC2結(jié)合位點(diǎn)E-box的基因，設(shè)計(jì)了相應(yīng)的探針，進(jìn)行了電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，SmMYC2a能夠與酚酸類

7、合成途徑中的關(guān)鍵基因SmRAS6，SmCYP98A14結(jié)合，SmMYC2b能夠與SmCYP98A14結(jié)合，證明SmMYC2a可能通過(guò)調(diào)控SmRAS6，SmCYP98A14來(lái)影響酚酸類化合物的合成，SmMYC2b可能通過(guò)調(diào)控SmCYP98A14影響酚酸類化合物的合成。
　　為研究MYC2的激活機(jī)制，進(jìn)行了酵母雙雜交（Yeast two hybrid，Y2H）實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，SmMYC2a/b和SmJAZ1，SmJAZ2均有很強(qiáng)的互作

8、，證明這兩個(gè)MYC2是SmJAZ1和SmJAZ2的靶標(biāo)蛋白，且MYC2-JAZ的結(jié)合抑制了MYC2對(duì)關(guān)鍵酶基因(SmRAS6和SmCYP98A14)的轉(zhuǎn)錄激活。
　　綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)JA信號(hào)關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SmMYC2調(diào)控丹參酮和丹參酚酸合成的功能研究，建立了JA-MYC2-關(guān)鍵酶基因-有效成分的網(wǎng)絡(luò)，拓展了人們對(duì)丹參有效成分生物合成調(diào)控的認(rèn)識(shí)，從而為闡明丹參有效成分的合成和調(diào)控途徑，進(jìn)而為開(kāi)展生物合成途徑的遺傳改造、培育優(yōu)良品