結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)錄因子WhiB2蛋白的功能和轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、結(jié)核病死灰復(fù)燃,是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病。2010年,估算全球新發(fā)結(jié)核病患者880萬(wàn)例,未感染艾滋病的結(jié)核病患者死亡人數(shù)為110萬(wàn),另有35萬(wàn)死于艾滋病病毒感染相關(guān)結(jié)核病。隨著人類社會(huì)和藥物治療的發(fā)展,人們對(duì)結(jié)核病的致病菌——結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)的生物學(xué)特性有了進(jìn)一步的研究,繼而研發(fā)了鏈霉素、異煙肼、利福平等治療性藥物,使得人類對(duì)結(jié)核病的控制取得了可喜的成績(jī),遏制了結(jié)核病的蔓延和傳播。

2、1995年至2010年間,在實(shí)施了現(xiàn)代結(jié)核病控制策略/遏制結(jié)核病策略的結(jié)核病防治規(guī)劃中,5500萬(wàn)例結(jié)核病患者得到了治療,4600萬(wàn)例患者獲得成功治療,這些治療挽救了近700萬(wàn)人的生命。然而由于化學(xué)藥物的不合理應(yīng)用、艾滋病與結(jié)核病共感染、人口流動(dòng)的增加以及耐藥結(jié)核病菌的流行,使得近年來(lái)結(jié)核病疫情下降緩慢,在部分地區(qū)甚至有所回升。當(dāng)前,在結(jié)核病控制工作中急需有效的預(yù)防性、治療性疫苗和新型藥物。尋找新的藥物作用靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)新型抗結(jié)核藥物已成為

3、當(dāng)前最為關(guān)注的焦點(diǎn)。
　　 whi基因普遍存在于放線菌屬和分枝桿菌屬中,因其突變能導(dǎo)致天藍(lán)色鏈霉菌菌落呈白色而得名。whiB是whi基因中的一類,其編碼的蛋白功能涉及孢子形成、細(xì)胞分裂、致病性以及營(yíng)養(yǎng)缺陷等壓力傳感。經(jīng)ProteinSequenceAnalysis(PSA)server分析顯示W(wǎng)hiB樣具有helix-turn-helix(HTH)基序,是可能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。結(jié)核分枝桿菌具有7個(gè)WhiB-like蛋白(WBL),

4、為WhiB1～7。序列分析顯示這些WBL都具有四個(gè)保守的半胱氨酸殘基,且排列為“C-X19-36-C-X-X-C-X5-7-C”,C-X-X-C可以和[2Fe-2S]配位。通過(guò)同源性分析,發(fā)現(xiàn)除了WhiB5和WhiB6,結(jié)核分枝桿菌中其它5個(gè)WhiB蛋白在分枝桿菌屬中的同源性都很高。但是結(jié)核分枝桿菌7個(gè)WBL蛋白的功能還沒(méi)有完全詮釋。與胰島素共孵育檢測(cè)蛋白的二硫鍵還原功能,結(jié)果表明除了WhiB2,其他6個(gè)WhiB蛋白都能夠還原胰島素的二

5、硫鍵。WhiB1是唯一的在結(jié)核分枝桿菌中被發(fā)現(xiàn)的受cAMP受體蛋白CRP調(diào)控的蛋白,能夠與結(jié)核分枝桿菌體內(nèi)最佳生長(zhǎng)所必需的基因glgB相互作用。WhiB3與組織損傷有關(guān),且結(jié)核分枝桿菌調(diào)節(jié)whiB3的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)體內(nèi)的環(huán)境信號(hào)。M.tuberculosisH37Rv的whiB7無(wú)效突變菌株對(duì)多種抗生素(四環(huán)素,林可霉素,紅霉素)高度敏感,表明WhiB7蛋白與壓力傳感有關(guān)。在M.tuberculosisCDC1551中檢測(cè)7個(gè)WbL在不同抗

6、分枝桿菌因子和其它的壓力條件下的表達(dá)情況,結(jié)果表明作用于核糖體的氨基苷類一鏈霉素和卡那霉素一刺激whiB7的表達(dá)。在PH4.5的酸性條件下,whiB6和whiB3的表達(dá)特異性增高
　　 在恥垢分枝桿菌中過(guò)表達(dá)WhiBTM4,導(dǎo)致恥垢分枝桿菌表現(xiàn)出WhiB2敲除表型,即阻礙隔膜的形成,表明WhiBTM4下調(diào)WhiB2。研究表明結(jié)核分枝桿菌WhiB2蛋白與恥垢分枝桿菌WhmD蛋白的功能是相同的。whmD是必需基因,恥垢分枝桿菌染色體

7、上whmD的缺失導(dǎo)致不可逆的,分枝生長(zhǎng)呈現(xiàn)減少的隔膜形成,說(shuō)明該基因和細(xì)胞分裂有關(guān),但是與細(xì)胞分裂相關(guān)的具體機(jī)制目前尚不清楚。為了研究WhiB2與細(xì)胞分裂的機(jī)制及其功能,本研究將結(jié)核分枝桿菌whiB2基因克隆到穿梭質(zhì)粒pNIT-myc中,得到重組質(zhì)粒pNIT-myc-whiB2,再用電穿孔的方法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌中得到過(guò)表達(dá)WhiB2蛋白的恥垢分枝桿菌重組菌株。然后研究whiB2的過(guò)表達(dá)對(duì)恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng),對(duì)過(guò)氧化氫的敏感性及

8、對(duì)與細(xì)胞分裂有關(guān)基因的表達(dá)的影響,檢測(cè)了抗分枝桿菌抗生素對(duì)恥垢分支桿菌的MIC。結(jié)果表明whiB2的過(guò)表達(dá)對(duì)恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)并沒(méi)有什么影響,卻使恥垢分枝桿菌增加了對(duì)異煙肼和卷曲霉素的敏感性,而對(duì)過(guò)氧化氫的耐受性明顯增加。RT-PCR結(jié)果顯示W(wǎng)hiB2的過(guò)表達(dá)使與細(xì)胞分離有關(guān)的基因MSEMG_4225和ftsZ的表達(dá)量增加。熒光顯微鏡分析顯示W(wǎng)hiB2蛋白的過(guò)表達(dá)使得細(xì)胞分裂加快。總而言之,我們的研究表明了結(jié)核分枝桿菌WhiB2與抗生素