結(jié)核分枝桿菌GntR家族轉(zhuǎn)錄因子Rv1152在萬(wàn)古霉素耐受中的分子機(jī)理研究.pdf

1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染導(dǎo)致的一種嚴(yán)重危害公共健康的慢性傳染病，至今仍然是一種高傳染性和高死亡率的疾病。目前結(jié)核病仍然是全球公共衛(wèi)生的重大威脅。近年來(lái)隨著耐多藥結(jié)核菌（MDR）、廣泛耐藥結(jié)核菌(XDR)、全耐藥結(jié)核菌（TDR）及與HIV共感染的出現(xiàn)，結(jié)核病的防治更加嚴(yán)峻，急需探索治療結(jié)核病的新方法。基因表達(dá)調(diào)控對(duì)結(jié)核菌適應(yīng)各種外界環(huán)境壓力起著關(guān)鍵性作用，包括低氧、營(yíng)養(yǎng)匱乏、抗生素壓力、低PH及氮氧化壓力等。
　　GntR家族轉(zhuǎn)錄

2、因子廣泛存在于細(xì)菌基因組中，已經(jīng)有2000個(gè)GntR家族轉(zhuǎn)錄因子成員在細(xì)菌和古細(xì)菌基因組中被發(fā)現(xiàn)。先前研究發(fā)現(xiàn)GntR轉(zhuǎn)錄因子通過變構(gòu)效應(yīng)調(diào)控細(xì)菌代謝、耐藥和毒力等基因的表達(dá)。結(jié)核分枝桿菌中有7個(gè)編碼GntR家族的基因。Rv0494是一個(gè) GntR家族蛋白，該蛋白參與結(jié)核分枝桿菌脂肪酸代謝。我們研究的Rv1152編碼一個(gè)潛在的GntR家族蛋白。先前研究報(bào)道結(jié)核分枝桿菌Rv1152在饑餓環(huán)境下上調(diào)表達(dá)15倍，表明Rv1152可能與結(jié)核分枝

3、桿菌持留和耐藥相關(guān)。為了探究Rv1152在結(jié)核分枝桿菌持留和耐藥中的作用，我們構(gòu)建了能夠表達(dá)Rv1152蛋白的重組恥垢分枝桿菌(MS_Rv1152)和空載重組恥垢分枝桿菌(MS_Vec)。通過亞細(xì)胞定位分析證明了Rv1152定位于恥垢分枝桿菌細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁。我們發(fā)現(xiàn)MS_Rv1152在體外壓力條件下對(duì)酸更敏感，而對(duì)SDS顯著耐受。萬(wàn)古霉素屬于糖肽類抗生素主要作用靶標(biāo)位于細(xì)菌的細(xì)胞壁中，已有研究報(bào)道用不同濃度的萬(wàn)古霉素處理結(jié)核分枝桿菌后R

4、v1152表達(dá)上調(diào)，我們的結(jié)果證明MS_Rv1152對(duì)抗生素萬(wàn)古霉素非常耐受，這說(shuō)明Rv1152可能通過調(diào)控某些耐藥基因或壓力耐受基因的表達(dá)而對(duì)外界壓力以及抗生素具有耐受性。為了進(jìn)一步探究Rv1152蛋白在萬(wàn)古霉素耐受中的機(jī)制，我們構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌基因Rv1152在恥垢分枝桿菌中的同源基因MSMEG_5174缺失菌株（△MSMEG_5174）和回補(bǔ)菌株（△MSMEG_5174::Rv1152）。我們發(fā)現(xiàn)△MSMEG_5174突變菌株對(duì)

5、萬(wàn)古霉素非常敏感，而回補(bǔ)菌株能夠恢復(fù)原有的表型，這說(shuō)明 Rv152可能調(diào)控了參與萬(wàn)古霉素耐受的相關(guān)基因。先前研究報(bào)道萬(wàn)古霉素處理結(jié)核分枝桿菌后表達(dá)上調(diào)倍數(shù)較高同時(shí)又受到Rv1152調(diào)控的40個(gè)基因，通過半定量RT-PCR和熒光定量PCR檢測(cè)了其中在恥垢分枝桿菌中具有同源基因的23個(gè)基因在重組菌MS_Rv1152和MS_Vec，以及△MSMEG_5174，WT和△MSMEG_5174::Rv1152中的表達(dá)情況。我們發(fā)現(xiàn)Rv1152蛋白抑

6、制了與萬(wàn)古霉素相關(guān)的4個(gè)基因的表達(dá)，包括熱激蛋白Hsp，硫酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶CysD，L-賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移酶Lat和跨膜蛋白水解酶HtpX。為了進(jìn)一步探究這4個(gè)基因是否與萬(wàn)古霉素敏感相關(guān)，我們構(gòu)建了4個(gè)結(jié)核分枝桿菌的基因以及其在恥垢分枝桿菌中的4個(gè)同源基因在恥垢分枝桿菌中的過表達(dá)菌株，用不同濃度萬(wàn)古霉素處理這些重組菌后，發(fā)現(xiàn)這些過表達(dá)菌株均對(duì)萬(wàn)古霉素有不同程度的敏感，尤其是Lat和HtpX基因過表達(dá)菌株。
　　以上的研究結(jié)果表明Rv1