耐萬(wàn)古霉素腸球菌分子特性研究.pdf

1、腸球菌是革蘭陽(yáng)性球菌，是臨床上較常見(jiàn)的一類條件致病菌，它可導(dǎo)致人體多臟器的感染，引起臨床感染的主要為糞腸球菌(E.faecalis)和屎腸球菌(E.faecium)。近年來(lái)由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，腸球菌引起的醫(yī)院感染呈逐漸上升趨勢(shì)，其已成為引起醫(yī)院感染的第二大病原菌。自上世紀(jì)80年代首次分離得到第一株耐萬(wàn)古霉素腸球菌(Vancomycinresistantenterocoecus，VRE)以來(lái)，糖肽類抗生素耐藥腸球菌的數(shù)量不斷增多，甚至

2、出現(xiàn)了其耐藥性向其他細(xì)菌轉(zhuǎn)移的嚴(yán)重現(xiàn)象。世界多個(gè)國(guó)家都相繼出現(xiàn)了有關(guān)VRE的報(bào)道，目前VRE已經(jīng)成為衛(wèi)生部門(mén)所面臨的重要威脅與挑戰(zhàn)。目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)十分有效的治療VKE的藥物，所以耐藥菌株的臨床治療相當(dāng)困難，而且治療費(fèi)用較高。一般治療原則為通過(guò)檢測(cè)病原菌對(duì)藥物的敏感性，來(lái)選擇合適的抗感染藥物。大量研究表明參考VKE耐藥表型對(duì)治療藥物選用具有重要的指導(dǎo)意義。本研究通過(guò)檢測(cè)臨床分離腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素及替考拉寧的MIC，從而了解耐藥株的耐藥表型，

3、并同時(shí)檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因，探討了腸球菌產(chǎn)生萬(wàn)古霉素耐藥性的分子生物學(xué)機(jī)制，并對(duì)篩選到的VRE菌株進(jìn)行了6種臨床常用抗生素的耐藥性檢測(cè)，為臨床合理選用抗生素提供依據(jù)；同時(shí)，對(duì)VRE菌株通過(guò)PFGE及MLST進(jìn)行克隆分型，為分子流行病學(xué)研究提供有價(jià)值的信息，這對(duì)于細(xì)菌性傳染病監(jiān)測(cè)，傳染源追蹤、傳播途徑調(diào)查和識(shí)別等暴發(fā)調(diào)查有著非常重要的意義。
　　第一部分耐萬(wàn)古霉素腸球菌耐藥表型及基因型檢測(cè)
　　目的：調(diào)查上海華山醫(yī)院2007-

4、2009年間890株臨床腸球菌的VRE分離率，以及耐藥菌株的耐藥表型，并對(duì)篩選到的菌株檢測(cè)其對(duì)臨床常用的其他6種抗生素的敏感性，為臨床合理應(yīng)用抗生素提供依據(jù)。同時(shí)從分子水平上研究耐藥株的耐藥基因，為同種耐藥基因型別菌株的分子流行學(xué)研究提供參考依據(jù)。
　　方法：收集上海華山醫(yī)院2007年1月～2009年6月890株腸球菌，采用瓊脂平板篩選法(ADSP)篩選耐藥菌株，同時(shí)按照CLSI推薦的方法以微量肉湯稀釋法對(duì)篩選出的13株疑似VRE

5、檢測(cè)其對(duì)萬(wàn)古霉素及替考拉寧的MIC。除此以外，我們還采用E-test方法檢測(cè)了耐藥株對(duì)臨床常用的治療腸球菌感染的6種抗生素(慶大霉素，氨芐青霉素、利奈唑胺、紅霉素，環(huán)丙沙星、氯霉素)的敏感性。采用PCR及測(cè)序方法檢測(cè)萬(wàn)古霉素耐藥基因(vanA，vanB，vanK)。
　　結(jié)果：采用瓊脂平板篩選法(ADSP)篩選得到13株疑似VRE，微量肉湯稀釋法確證13株疑似VRE均對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥。其中6株(2007-2008)均對(duì)萬(wàn)古霉素高度耐

6、藥，但對(duì)替考拉寧敏感(萬(wàn)古霉素MIC≥64～256mg/L)，耐藥基因檢測(cè)結(jié)果提示其均攜帶同一種可能導(dǎo)致萬(wàn)古霉素耐藥的新型基因，該基因序列與現(xiàn)有的已報(bào)道的耐藥基因均不同(本文中將其暫定為vanX)，另外，7株(2009)VRE菌株對(duì)萬(wàn)古霉素及替考拉寧均耐藥，對(duì)萬(wàn)古霉素及替考拉寧的MIC分別為32～64mg/L和16～32mg/L，耐藥基因檢測(cè)結(jié)果提示其均攜帶vanA耐藥基因。
　　討論：上海華山醫(yī)院2007年1月～2009年6月間

7、存在對(duì)萬(wàn)古霉素及替考拉寧均耐藥的VanA型耐藥表型，該表型耐藥基因容易轉(zhuǎn)移，易在臨床中發(fā)生耐藥性的大范圍播散。同時(shí)該表型為獲得性耐藥，提示與抗生素的濫用密切相關(guān)，值得引起臨床有關(guān)部門(mén)注意。另一方面，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)了可能導(dǎo)致萬(wàn)古霉素耐藥的新型基因vanX介導(dǎo)的VRE的存在，該新基因的功能和定位尚待進(jìn)一步研究。
　　第二部分耐萬(wàn)古霉素腸球菌的基因分型及毒力研究
　　目的：為檢測(cè)耐藥流行株是否正在傳播，可將分離株進(jìn)行分子生物學(xué)

8、分型，通過(guò)分型可以鑒定比較菌株是否一致，對(duì)于細(xì)菌性傳染病監(jiān)測(cè)，傳染源追蹤、傳播途徑調(diào)查和識(shí)別等暴發(fā)調(diào)查有著非常重要的意義。同時(shí)檢測(cè)耐藥菌株的可能毒力因子的攜帶情況以及耐藥克隆株的生物膜的形成能力方法。
　　方法：采用多位點(diǎn)測(cè)序分型方法(MLST)以及脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)對(duì)耐藥菌株進(jìn)行克隆分型，同時(shí)運(yùn)用PCR結(jié)合測(cè)序方法檢測(cè)耐藥菌株的毒力因子esp及hyl基因。另一方面，我們還通過(guò)微量滴定板制備生物膜的方法來(lái)檢測(cè)菌株的生物膜形

9、成能力。
　　結(jié)果：13株VRE分離株代表4種不同的ST型。其中4株為ST18，6株VRE為ST78，2株為ST341，1株為ST203，11株VRE同屬于同一個(gè)克隆復(fù)合型(ClonalCompleX)CC17。6株由vanX基因介導(dǎo)耐藥的VRE的PFGE分型不同，MLST及PFGE分型結(jié)果都提示這6株VRE屬于不同型別，可見(jiàn)其不是單克隆流行播散。13株VRE毒力基因esp和hyl的陽(yáng)性率分別為69.2％和30.8％。微量滴定板制

10、備生物膜方法檢測(cè)菌株的生物膜形成能力結(jié)果提示13株VRE不具有生物膜形成能力。
　　結(jié)論：13株VRE的MLST及PFGE分型結(jié)果提示華山醫(yī)院的VRE的克隆株均為多克隆流行，且大多數(shù)菌株屬于同一克隆復(fù)合型CC-17，具有一些共同的耐藥特征。6株vanX基因型VRE中，雖然esp基因攜帶率為83.3％，但不具有生物膜形成能力。
　　第三部分vanX耐藥基因定位研究
　　目的：了解vanX新型萬(wàn)古霉素耐藥基因在導(dǎo)致萬(wàn)古霉素

11、耐藥的確切作用機(jī)制并且對(duì)該基因進(jìn)行定位研究。
　　方法：構(gòu)建含有VanX基因的重組質(zhì)粒PRB473-VanX，并將其轉(zhuǎn)化至工具菌saRN4220中，觀察受體菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥表型是否發(fā)生改變，從而證明該基因在導(dǎo)致萬(wàn)古霉素耐藥性的作用。另一方面，我們通過(guò)質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)，并通過(guò)PFGE及體外藥敏試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證耐藥株是否通過(guò)接合作用將耐藥相關(guān)基因轉(zhuǎn)移到受體菌中，從而使受體菌由萬(wàn)古霉素敏感株變?yōu)槿f(wàn)古霉素耐藥株。
　　結(jié)果：VanX基因轉(zhuǎn)化

12、實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚存有爭(zhēng)議，疑似轉(zhuǎn)化成功的克隆株用劃線法接種在含有萬(wàn)古霉素的TSB平板上，24h后有菌落生長(zhǎng)，但只存在于劃線一區(qū)，同時(shí)陰性對(duì)照平板上無(wú)菌落生長(zhǎng)；在質(zhì)粒接合實(shí)驗(yàn)中，6株由VanX基因介導(dǎo)的VRE菌株為供體菌進(jìn)行接合試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗生素篩選平板上有一株菌株出現(xiàn)了生長(zhǎng)，表示接合轉(zhuǎn)移成功，之后的體外藥敏試驗(yàn)也證明受體菌由對(duì)萬(wàn)古霉素敏感變?yōu)槟退?，同時(shí)PFGE驗(yàn)證結(jié)果發(fā)現(xiàn)接合后的菌體的DNA條帶信息與受體菌BM-4105RF不同，但是包含有