新型手性整體柱的制備及其在氨基酸手性拆分中的應用研究.pdf

1、氨基酸是存在于生命體中的一種重要的手性化合物。隨著對映體手性拆分色譜技術(shù)的發(fā)展，D-型氨基酸被逐漸認為是哺乳動物體內(nèi)的生理功能活性分子及重要的生物標記物。因此，開發(fā)新型手性固定相并應用于生物樣品中微量D-型氨基酸的檢測成為人們關(guān)注的焦點。目前已有多種手性固定相被應用于N-衍生化氨基酸的手性拆分，如：纖維素、環(huán)糊精、奎尼丁等。其中奎尼丁填充柱選擇性好且分離能力突出，被廣泛應用于哺乳動物體內(nèi)氨基酸的手性拆分。但填充柱存在分析時間長，通透性較

2、差和柱壓高等缺點。有機聚合物整體柱具有制備簡單、通透性高、耐酸堿穩(wěn)定性好等特點，可有效改善傳統(tǒng)色譜分離介質(zhì)的不足而備受關(guān)注。因此，本論文的研究重點是設計和制備具有高手性識別能力的新型功能化手性整體柱，并在此基礎之上開發(fā)基于手性整體柱的離線2D-HP LC技術(shù)用于茶葉中微量D-型氨基酸的分離分析。
　　第一章，系統(tǒng)介紹了氨基酸手性拆分的重要性和常見的拆分方法，并概述了幾類重要的手性固定相的拆分機理及應用。重點對奎尼丁整體柱和環(huán)糊精整

3、體柱的發(fā)展現(xiàn)狀及其在氨基酸手性拆分上的應用進行了詳細綜述，在此基礎上提出了本論文的研究思路及創(chuàng)新點。
　　第二章，以 O-[2-(甲基丙烯酰氧基)乙基氨基甲酰基]-10,11-二氫奎尼?。∕QD）為功能性單體，十二醇和環(huán)己醇為生孔劑，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發(fā)劑，在內(nèi)徑為100μm的毛細管內(nèi)通過熱致原位聚合反應制備出通透性、選擇性和柱效等均滿足微徑液相色譜模式的poly(MQD-co-

4、EDMA)整體柱，并將其用于44種 N-衍生化氨基酸的手性拆分。對比相同分析物在poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA)整體柱上的分離結(jié)果，發(fā)現(xiàn)poly(MQD-co-EDMA)整體柱表現(xiàn)出與 poly(MQD-co-HEMA-co-EDMA)整體柱相近的手性選擇性，說明共聚單體HEMA對奎尼丁整體柱的手性選擇性影響不大。
　　第三章，為了提高氨基酸在整體柱上的檢測靈敏度，自主構(gòu)建micro-LC/LIF系統(tǒng)，并將其與p

5、oly(MQD-co-EDMA)整體柱聯(lián)用，用于10種NBD-衍生化氨基酸的手性拆分。研究表明，包含NBD-Arg在內(nèi)的5種NBD-衍生化氨基酸均能在該整體柱上實現(xiàn)基線分離（其中NBD-Arg為首次報道在奎尼丁固定相上實現(xiàn)基線分離），并且發(fā)現(xiàn)除NBD-Glu外的所有氨基酸衍生物的D-型對映體通常被最先洗脫出來。同時對比了NBD-Gln在不同檢測系統(tǒng)下（紫外和熒光）的檢測限和定量限，發(fā)現(xiàn)熒光檢測器的引入使得氨基酸在整體柱上的檢測靈敏度提高

6、了近3000倍，達到了fmol級別。大量 L-型氨基酸存在下D-型氨基酸的相對檢測限（RLOD，0.17％）和相對定量限（RLOQ，0.25%）表明，micro-LC/LIF系統(tǒng)與 poly(MQD-co-EDMA)整體柱的聯(lián)用有潛力應用于實際樣品中微量D-型氨基酸的分離分析。
　　第四章，在本課題組的前期研究基礎之上，自主構(gòu)建離線2D-HPLC系統(tǒng)（第一維：利用反相C18柱分離茶葉提取物中的不同氨基酸組分；第二維：利用纖維素手性

7、柱Chirakpak(R)IC-3和poly(MBQD-co-HEMA-co-EDMA)奎尼丁整體柱分別對第一維所收集的各個氨基酸組分進行手性拆分，計算每種氨基酸中D-型對映體的比例），首次對茶葉中的微量D-型氨基酸進行分離分析。結(jié)果顯示，烏龍茶提取物中不同D-型氨基酸對映體的比例分別為Ile（1.09%）、Ser（0.30%）、Asp（0.25%）、Val（0.17%）、Ala（0.07%）和Pro（0.04%）。
　　第五章，

8、以heptakis(2,3-di-O-acetyl)-mono(6-O-methacryloyl)-β-cyclodextrin（HDAM-β-CD）為功能性單體，正丙醇（NPA）、1,4-丁二醇（BDO）和H2O為生孔劑，EDMA為交聯(lián)劑，AIBN為引發(fā)劑，制備出通透性、選擇性和柱效等均滿足微徑液相色譜模式的poly(HDA-β-CD-co-EDMA)整體柱；并對最佳條件下制備的poly(HDA-β-CD-co-EDMA)整體柱的各項