緩解氧化應(yīng)激Lactobacillus fermentum L8的篩選及益生機(jī)制研究.pdf

1、機(jī)體衰老及很多慢性疾病如糖尿病、癌癥、肝硬化、動脈粥樣硬化等發(fā)生都與體內(nèi)自由基過度產(chǎn)生有關(guān)，臨床表明通過膳食補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)可清除體內(nèi)過多產(chǎn)生的自由基，維持機(jī)體氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡。隨著“人類腸道元基因組計劃”的實施，乳酸菌緩解氧化應(yīng)激、輔助降膽固醇及調(diào)節(jié)腸道菌群等益生功能已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究熱點。因此，基于人源腸道微生態(tài)，篩選具有突出緩解氧化應(yīng)激能力的益生菌，闡明益生菌對機(jī)體氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制，開發(fā)具有緩解氧化應(yīng)激損傷

2、的功能性益生菌株，具有一定的理論研究價值，也是制備高品質(zhì)發(fā)酵劑及發(fā)酵產(chǎn)品的關(guān)鍵。本論文根據(jù)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點實驗室建立的體外抗氧化功能益生菌的篩選模型，從江蘇如皋長壽人群腸道內(nèi)分離、篩選、鑒定、獲得發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentumL8)，建立酒精性肝損傷氧化應(yīng)激及高脂膳食誘導(dǎo)氧化應(yīng)激兩個動物模型，綜合運用考察L.fermentumL8對模型大鼠緩解氧化應(yīng)激的抗氧化效應(yīng)及關(guān)鍵指標(biāo)水平變化的相關(guān)性分析

3、，以期從分子、細(xì)胞和基因水平上闡明L.fermentumL8對氧化應(yīng)激損傷的拮抗規(guī)律及相關(guān)作用機(jī)制，為益生菌高效利用及相關(guān)功能食品開發(fā)提供理論和技術(shù)支持。
　　1.具有優(yōu)良抗氧化功能特性益生菌株的體外篩選
　　通過分析實驗室初篩的江蘇如皋長壽人群體內(nèi)分離得到30株人源乳酸菌發(fā)酵液的羥自由基(OH·)、DPPH自由基的清除能力和還原能力，初步篩選出抗氧化活性較高的9株菌株。其中L8對OH·的清除能力為69.96％，對DPPH·

4、清除能力為85.27％，還原力A700nm為2.85，研究發(fā)現(xiàn)菌株對·OH、DPPH·清除能力及還原能力三個指標(biāo)之間沒有相關(guān)性，表明菌株發(fā)揮抗氧化作用物質(zhì)基礎(chǔ)不相同。
　　研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)9株菌發(fā)酵液的不同組分（發(fā)酵上清液、菌體和胞內(nèi)提取物）均具有抗氧化特性，但不同組分的抗氧化特性有一定差異，其中發(fā)酵上清液的自由基清除能力和還原能力均顯著高于菌體和胞內(nèi)提取物(P＜0.05);發(fā)酵液的抗氧化能力與其各組分抗氧化能力之和并不相等。綜合比

5、較確定4株目標(biāo)菌株，考察了37℃培養(yǎng)24 h的SOD及GSH-Px活性，其中L8最高的SOD為33.4U/mL，GSH-Px為38.2 U/mL。
　　通過人工模擬胃、腸道環(huán)境，進(jìn)一步研究4株乳酸菌的耐酸耐膽鹽能力，并研究其體外降膽固醇能力。結(jié)果表明，菌株L8在pH值為2.0和3.0的模擬人工胃液中培養(yǎng)3h的存活率分別為37.01％和68.55％，5h后存活率分別為10.28％和23.39％;在模擬人工腸液中1.5h后的存活率為6

6、6.45％,3 h后的存活率為46.84％;在0.1％，0.3％及0.5％膽鹽環(huán)境中的耐受力分別為24.11％，20.31％和19.92％;在0.1％的膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下其對膽固醇降解率最高為63.73％。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)0.1％的膽鹽濃度是L8發(fā)揮降解膽固醇效應(yīng)的最佳濃度。
　　研究發(fā)現(xiàn)菌體發(fā)酵上清液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌這3種致病菌均有一定抑制能力，通過調(diào)整pH排除抑菌物質(zhì)是酸，通過熱處理排除抗菌物質(zhì)是蛋白質(zhì)，通過不同

7、蛋白酶處理后推論抑菌活性物質(zhì)可能是一類熱穩(wěn)定小分子多肽類細(xì)菌素說明菌株L8具有潛在的抗氧化、耐酸、耐膽鹽及降解膽固醇特性。
　　2.乳酸菌L8的鑒定及應(yīng)用基礎(chǔ)研究
　　經(jīng)生理生化、API80CHL及16S rRNA測序鑒定，將菌株L8鑒定為發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum，和標(biāo)準(zhǔn)菌株L.fermentum CECT5716的同源性達(dá)到100％。
　　研究L.fermentumL8生長、發(fā)酵特性，

8、發(fā)現(xiàn)菌株在培養(yǎng)4h后進(jìn)入對數(shù)生長期，在10h到達(dá)穩(wěn)定期，34h后數(shù)量開始略微下降;發(fā)酵乳的組織狀態(tài)細(xì)膩，凝乳時的酸度變化較小;經(jīng)5次傳代后凝乳時間和酸度較為穩(wěn)定，后酸化較弱，粘度上升較大，說明該菌株發(fā)酵穩(wěn)定性較好。
　　L.fermentum L8表面疏水性及對IEC-6細(xì)胞的黏附能力較強(qiáng)，和陽性對照BB-12相近，有助于其在體內(nèi)發(fā)揮其益生作用。
　　L.fermentum L8的耐藥譜相對較窄，對妥布霉素、阿米卡星、萬古霉

9、素和卡那霉素具有一定的耐受性，對青霉素G、氯霉素、哌拉西林較為敏感。
　　3.L.fermentum L8對大鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)的實驗研究
　　成功建立慢性酒精性肝損傷大鼠模型，用不同濃度L.fermentum L8發(fā)酵液進(jìn)行干預(yù)。測定各組大鼠的體重、臟器指數(shù)、血清、肝勻漿生化指標(biāo)，并采用流式細(xì)胞儀測定了各組肝細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)量和肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)。
　　結(jié)果表明:L.fermentum L8干預(yù)后，大鼠體重增

10、長較快，肝指數(shù)也恢復(fù)至正常水平;L fermentum L8的干預(yù)能顯著降低大鼠血清的內(nèi)毒素含量(P＜0.05)，說明L8在腸道的黏附降低了腸道黏膜的通透性，降低血液中的內(nèi)毒素含量;
　　與模型組相比，高濃度三.fermentum L8組能顯著降低血清ALT、AST水平(P＜0.05)，升高SOD含量(P＜0.05)，顯著升高肝勻漿SOD、GSH和GSH-Px含量(P＜0.05)，降低MDA水平(P＜0.05);表明L.ferme

11、ntum L8能通過減輕脂質(zhì)在肝臟積聚，清除自由基、緩解氧化應(yīng)激，有效減輕自由基對細(xì)胞膜的損傷;
　　與模型組相比，高濃度L.fermentum L8能顯著升高大鼠肝臟ADH、Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase含量(P＜0.05);顯著降低大鼠肝臟TNF-α、IL-6、VEGF TGF-β1、和NF-κB等炎性因子的表達(dá)水平(P＜0.05);大鼠肝臟的Nrf2蛋白表達(dá)量顯著升高(P＜0.05);肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)顯著

12、降低(P＜0.05)。相關(guān)性分析表明L.fermentum L8可能通過加快線粒體電子呼吸鏈傳遞速度和提高氧化磷酸化效率保證了線粒體膜ATP酶所需能量的供應(yīng)，以及增加細(xì)胞內(nèi)GSH等氧化酶的水平，達(dá)到提高抗氧化能力、抑制促炎因子、減輕肝損傷的炎癥反應(yīng)、減少干細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而起到緩解氧化應(yīng)激能力的效應(yīng)。
　　4.L.fermentum L8緩解高脂膳食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激實驗研究
　　利用高脂膳食飼喂大鼠誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型，評價L.fe

13、rmentum L8在體內(nèi)緩解高脂膳食誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的能力。研究結(jié)果表明，L.fermentum L8能緩解高脂膳食誘導(dǎo)的大鼠血液和肝臟中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激。
　　與模型組相比，L.fermentum L8干預(yù)均能顯著改善大鼠的臟體系數(shù)(P＜0.05）;而與對照組則無顯著性差異(P＞0.05）;顯著降低大鼠的血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、ALT、AST、高密度脂蛋白(HDL)、動脈粥樣硬化指數(shù)(AI)、抗動脈粥樣硬化指數(shù)(A

14、AI)水平(P＜0.05);顯著提高血清SOD酶活性(P＜0.05);顯著提高肝勻漿GSH、GSH-Px水平(P＜0.05)。
　　與模型組相比，L.fermentum L8干預(yù)能顯著降低(P＜0.05)高脂膳食誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型小鼠肝臟膽固醇的水平;糞便中膽固醇和膽汁酸的水平(P＜0.05);顯著增加了大鼠結(jié)腸內(nèi)容物T-AOC的含量(P＜0.05);顯著降低了大鼠結(jié)腸內(nèi)容物MDA的含量(P＜0.05);肝細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)顯著降低(P

15、＜0.05);電鏡透視發(fā)現(xiàn)，受損大鼠的肝臟、心臟組織結(jié)構(gòu)得到改善。
　　高脂膳食攝入引起模型小鼠腸道菌群發(fā)生改變，降低了大鼠腸道擬桿菌門的含量，同時增加了厚壁菌門的含量，而在干預(yù)L.fermentum L8及其發(fā)酵乳4周后，增加了大鼠腸道擬桿菌門的含量，降低了厚壁菌門的含量。L.fermentum L8及其發(fā)酵乳干預(yù)增加了大鼠腸道乳酸菌及雙歧桿菌的含量，降低大腸桿菌的含量。逆轉(zhuǎn)了高脂膳食飼喂小鼠的腸道菌群變化。相關(guān)性分析表明:結(jié)腸