氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：白癜風(fēng)是臨床常見(jiàn)的皮膚黏膜色素脫失性疾病，本病皮損多發(fā)生在曝光部位，重者可造成損容性表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的身心健康。白癜風(fēng)發(fā)病的具體機(jī)制目前尚不清楚，但造成本病發(fā)生的最終環(huán)節(jié)已經(jīng)證實(shí)為患者皮損局部黑素細(xì)胞被破壞。新近研究證實(shí)，黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)是導(dǎo)致白癜風(fēng)患者表皮黑素細(xì)胞破壞的關(guān)鍵因素。黑素細(xì)胞在受到內(nèi)外環(huán)境刺激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)過(guò)量的氧自由基可以干擾細(xì)胞的正常生理代謝、增殖和分化，并會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)機(jī)體針對(duì)自身黑素細(xì)胞的免

2、疫反應(yīng)，導(dǎo)致黑素細(xì)胞出現(xiàn)不可逆性損傷。既往研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞較正常人更易受到氧化應(yīng)激，但其中的具體機(jī)制尚未闡明。因此，明確白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞易受氧化應(yīng)激的具體機(jī)制對(duì)于闡明白癜風(fēng)發(fā)病的具體分子機(jī)制、提供針對(duì)性的臨床精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)具有極其重要的意義。
　　細(xì)胞自噬是真核生物細(xì)胞內(nèi)降解聚集蛋白、受損細(xì)胞器及外源微生物等的一種保守的生物學(xué)現(xiàn)象。既往研究指出細(xì)胞處于氧化應(yīng)激時(shí)胞內(nèi)增高的ROS可以通過(guò)多種信號(hào)途徑激活細(xì)胞自噬，保護(hù)細(xì)胞免

3、受氧化損傷。Nrf2-ARE通路已被證實(shí)是黑素細(xì)胞在氧化應(yīng)激時(shí)被激活的關(guān)鍵抗氧化通路，氧化應(yīng)激時(shí)胞內(nèi)增高的ROS可促進(jìn)蛋白Nrf2轉(zhuǎn)移入核，與細(xì)胞內(nèi)多種II相解毒酶和抗氧化分子基因啟動(dòng)子區(qū)域的ARE結(jié)合，從而轉(zhuǎn)錄促進(jìn)其表達(dá)以發(fā)揮對(duì)抗氧化損傷的作用。新近研究指出：自噬過(guò)程中關(guān)鍵蛋白p62啟動(dòng)子區(qū)的同樣有ARE結(jié)合位點(diǎn)，Nrf2可入核與p62啟動(dòng)子區(qū)域ARE結(jié)合，上調(diào)其表達(dá)，從而參與細(xì)胞自噬完成。我們課題組既往已經(jīng)證實(shí)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞存在Nr

4、f2-ARE通路異常，由此，我們提出如下的假說(shuō)：氧化應(yīng)激狀態(tài)下，正常黑素細(xì)胞內(nèi)ROS可通過(guò)激活Nrf2-P62通路促進(jìn)細(xì)胞自噬，保護(hù)黑素細(xì)胞抵抗氧化損傷。而白癜風(fēng)黑素細(xì)胞存在ROS激活Nrf2-P62通路異常，導(dǎo)致細(xì)胞自噬水平激活障礙，使白癜風(fēng)黑素細(xì)胞易受氧化損傷。
　　目的：
　　1.明確氧化應(yīng)激時(shí)細(xì)胞自噬在正常人黑素細(xì)胞抗氧化損傷中的作用；
　　2.分析氧化應(yīng)激時(shí)白癜風(fēng)黑素細(xì)胞自噬水平與正常人黑素細(xì)胞間的差異及其作

5、用；
　　3.揭示氧化應(yīng)激時(shí)Nrf2-p62通路對(duì)正常黑素細(xì)胞及白癜風(fēng)黑素細(xì)胞自噬的調(diào)控差異及其機(jī)制。
　　方法：
　　1.以不同濃度H2O2處理正常人黑素細(xì)胞系PIG1，CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活性，確定最佳的體外黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型；
　　2.H2O2處理細(xì)胞不同時(shí)間，以免疫印跡、透射電鏡及激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)正常人原代黑素細(xì)胞、正常人黑素細(xì)胞系PIG1、白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V細(xì)胞自噬的水平；
　　3

6、.H2O2、自噬抑制劑及自噬促進(jìn)劑處理細(xì)胞后，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)正常人原代黑素細(xì)胞、正常人黑素細(xì)胞系PIG1、白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位及胞內(nèi)ROS的變化情況。
　　4.分別以Nrf2、p62干涉片段或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常人黑素細(xì)胞系PIG1及白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V，再予以H2O2處理細(xì)胞后，以免疫印跡、Real-time PCR和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞自噬水平變化。
　　5.分別以Nrf2

7、干涉片段及p62過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V，再予以H2O2處理細(xì)胞后，以流式細(xì)胞技術(shù)、免疫印跡和激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位、胞內(nèi)ROS及細(xì)胞自噬水平變化。
　　結(jié)果：
　　1.體外培養(yǎng)的正常人原代黑素細(xì)胞及正常人黑素細(xì)胞系PIG1在H2O2作用下細(xì)胞活性呈濃度依賴性降低，0.5mM H2O2處理細(xì)胞24h可建立最佳的體外黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激模型；
　　2.H2O2作用細(xì)胞一段時(shí)間內(nèi)可呈時(shí)間

8、依賴性顯著刺激正常人原代黑素細(xì)胞及正常人黑素細(xì)胞系PIG1中自噬相關(guān)蛋白LC3II/I表達(dá)比值升高，細(xì)胞自噬溶酶體數(shù)量增多；
　　3.自噬促進(jìn)劑雷帕霉素預(yù)處理正常人原代黑素細(xì)胞及正常人黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞后，可顯著降低兩種細(xì)胞在H2O2作用后的細(xì)胞凋亡比例及胞內(nèi)ROS水平，顯著提高兩種細(xì)胞在H2O2作用后的細(xì)胞線粒體膜電位水平。自噬抑制劑氯喹預(yù)處理正常人原代黑素細(xì)胞及正常人黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞后，可顯著增高兩種細(xì)胞在H2O2作

9、用后的細(xì)胞凋亡比例及胞內(nèi)ROS水平，顯著降低兩種細(xì)胞在H2O2作用后的細(xì)胞線粒體膜電位水平；
　　4.H2O2作用正常人黑素細(xì)胞系PIG1一定時(shí)間后，細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3II/I表達(dá)比值及自噬溶酶體數(shù)量顯著高于H2O2作用白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V后。同時(shí)H2O2作用正常人黑素細(xì)胞系PIG1一定時(shí)間后，細(xì)胞凋亡比例及胞內(nèi)ROS水平顯著低于H2O2作用白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V后，細(xì)胞線粒體膜電位水平顯著高于H2O2作用

10、白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V后；
　　5.敲低正常人黑素細(xì)胞系PIG1中蛋白Nrf2表達(dá)后，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3II/I表達(dá)比值、蛋白p62水平及自噬溶酶體數(shù)量顯著低于轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組。敲低正常人黑素細(xì)胞系PIG1中蛋白p62表達(dá)后，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3II/I表達(dá)比值及自噬溶酶體數(shù)量顯著低于轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組。在敲低蛋白Nrf2的正常人黑素細(xì)胞系PIG1中過(guò)表達(dá)蛋白p62，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬

11、相關(guān)蛋白LC3II/I表達(dá)比值及自噬溶酶體數(shù)量顯著高于單純敲低蛋白Nrf2的正常人黑素細(xì)胞系PIG1組；
　　6.以氯喹預(yù)處理細(xì)胞以抑制胞內(nèi)蛋白經(jīng)自噬降解后，H2O2作用細(xì)胞不同時(shí)間段，正常人黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞內(nèi)蛋白Nrf2及P62的表達(dá)顯著高于白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V，正常人黑素細(xì)胞系PIG1細(xì)胞核內(nèi)蛋白Nrf2表達(dá)顯著高于白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V；
　　7.在白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V中過(guò)表達(dá)蛋白p6

12、2，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白LC3II/I比值及自噬溶酶體數(shù)量顯著高于白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V的轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組。在白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V中過(guò)表達(dá)蛋白p62，H2O2作用后的細(xì)胞凋亡比例及胞內(nèi)ROS水平顯著低于白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V的轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組，細(xì)胞線粒體膜電位水平顯著高于白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞系PIG3V的轉(zhuǎn)染空白對(duì)照組。
　　結(jié)論：通過(guò)本研究，我們首次明確了氧化應(yīng)激可促進(jìn)正常人黑素細(xì)胞中細(xì)胞自噬水平