三氧化二砷誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬及白血病發(fā)病機(jī)制研究.pdf

1、自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)過(guò)程，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象。自噬現(xiàn)象最早是Ashford和Porten于1962年用電子顯微鏡在人的肝細(xì)胞中觀察到。但直到近10年，隨著酵母模型的建立和基因技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)自噬分子機(jī)制和形態(tài)特點(diǎn)的了解才逐漸深入，并認(rèn)識(shí)到自噬性細(xì)胞死亡有別于凋亡。 凋亡又稱(chēng)Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡(Ⅰ型PCD)。在多細(xì)胞生物中，正是通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制，使正常機(jī)體內(nèi)衰老、無(wú)用、

2、損傷或有惡變潛能的細(xì)胞得以清除。細(xì)胞凋亡在維持組織、器官的正常形態(tài)和功能方面起著非常重要的作用。它將機(jī)體的組成成分限制在生理需要的范圍之內(nèi)。細(xì)胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及治療都有著非常密切的關(guān)系。 腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之一是逃逸凋亡，然而，近年來(lái)的研究提示腫瘤細(xì)胞能夠以涉及自噬的非凋亡途徑發(fā)生死亡。經(jīng)藥物處理后的腫瘤細(xì)胞可觀察到自噬液泡數(shù)量的增加。雌激素受體拮抗劑他莫西芬處理乳腺癌細(xì)胞株MCF27后，出現(xiàn)自噬液泡蓄積和細(xì)胞死亡，但幾乎

3、觀察不到凋亡的改變，3-MA和雌二醇可抑制細(xì)胞死亡，說(shuō)明他莫西芬誘導(dǎo)的自噬是一主動(dòng)過(guò)程；同樣，過(guò)氧化物酶體增殖因子活化受體C(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR C)配體作用的前列腺癌細(xì)胞也可觀察到自噬性細(xì)胞死亡。PPARC能夠上調(diào)抑癌基因PTEN在乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)，故PPARC配體可能通過(guò)PTEN調(diào)控自噬。其它藥物如長(zhǎng)春堿、三氧化二砷、雷帕霉素及維生素D衍生物亦能誘

4、導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬性死亡。 Bcl-2和Bcl-xL依賴(lài)Beclin1明顯增強(qiáng)凋亡刺激劑誘導(dǎo)的Bax/Bak-/-MEFs自噬性死亡效應(yīng)。然而，Saeki等發(fā)現(xiàn)反義下調(diào)Bcl-2蛋白可誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞HL-60發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡；Pattingre等進(jìn)一步證實(shí)Bcl-2能夠下調(diào)Beclin1依賴(lài)性自噬性細(xì)胞死亡。Bcl-2在不同的細(xì)胞中對(duì)自噬可能有不同的調(diào)控機(jī)制和效應(yīng)。 三氧化二砷(As2O3)作為一種抗腫瘤藥物，主要機(jī)制是

5、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，As2O3可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生非凋亡形式的死亡，國(guó)內(nèi)外已有很多研究報(bào)道。關(guān)于As2O3是否可誘導(dǎo)不同類(lèi)型白血病細(xì)胞發(fā)生非凋亡形式的死亡(如自噬等)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。 本博士學(xué)位論文共分為三部分，第一部分：三氧化二砷誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞系HepG-2自噬及其機(jī)制研究；第二部分：三氧化二砷誘導(dǎo)白血病HL-60細(xì)胞自噬及與Bcl-2關(guān)系的研究；第三部分：三氧化二砷誘導(dǎo)白血病K562細(xì)胞自噬及與凋亡的關(guān)系研究；本研究主要目的、方

6、法、結(jié)果和結(jié)論概述如下： 研究目的：測(cè)定不同濃度三氧化二砷誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞自噬水平改變；測(cè)定不同濃度三氧化二砷誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞自噬及與Bcl-2關(guān)系；測(cè)定不同濃度三氧化二砷誘導(dǎo)K562白血病細(xì)胞自噬；探討自噬、凋亡及與Bcl-2之間的關(guān)系，探討與白血病發(fā)生機(jī)制的關(guān)系，為揭示白血病的發(fā)病機(jī)制、為白血病靶向性藥物及自噬基因的靶向治療提供理論依據(jù)，以期為治愈白血病提供更好的方法。 研究方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：

7、用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液置37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞以2×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，行細(xì)胞爬片生長(zhǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度As2O3按As2O3不同濃度分為5組：OuM/L，1.0uM/L，2.0uM/L，4.0uM/L，8uM/L；各組分別于藥物處理24小時(shí)后用0.25％胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞或取出細(xì)胞爬片。 2.細(xì)胞形態(tài)觀察：分別于加藥前后倒置顯微鏡觀察，并攝片。 3.

8、MDC熒光染色檢測(cè)自噬：自噬泡(autophagicvacuoles，AV)的染色：取出細(xì)胞爬片，PBS洗兩次，除去含血清的培養(yǎng)基。用0.05mmol/LMDC于37℃溫育60min后，4％多聚甲醛固定15min，PBS洗兩次，晾干后觀察。使用熒光顯微鏡(Olympus)加用356nm發(fā)射濾片和545nm阻斷濾片進(jìn)行觀察和攝片。 4.自噬的流式細(xì)胞術(shù)(FCM)定量分析：以上述MDC染色方法染色，用Elite流式細(xì)胞儀(COULT

9、ER公司，USA)以488nm激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定MDC染色的熒光強(qiáng)度。將光散射及熒光數(shù)據(jù)存入計(jì)算機(jī)分析得出結(jié)果。 5.凋亡的流式測(cè)定：收集1×107細(xì)胞，PBS洗滌制成1×106cell·ml-1的懸液，將細(xì)胞懸液滴入預(yù)冷(-20℃)的70％乙醇中固定，4℃過(guò)夜，次日洗去乙醇，用含有0.1％Triton－100，0.1mmol·L-1EDTA5μg·ml-1PI的PBS溶液染色，同時(shí)加入100U·ml-1的RNase，室溫暗處孵育3

10、0min，洗去PI，重新懸浮，染色后0.5h內(nèi)上機(jī)，用CellquestVersion1.2.2軟件獲取10000個(gè)細(xì)胞并分析。 6.RT-PCR檢測(cè)bcl-2mRNA表達(dá)：37℃、飽和濕度、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)后，收集細(xì)胞，PBS洗兩次。RNA的提取采用異硫氰酸胍一步提取法，260/280nm測(cè)定其濃度和純度；RT-PCR步驟參照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明。PCR擴(kuò)增所用引物序列如下：bcl-2：Sense5'-TGTGGCC

11、TTCTTTGAGTTCG-3'，Antisense5'-TCACTTGTGGCTCAGATAGG-3'，片段280bp；β-actin：Sense5'-GGGTCAGAAGGATTCCTGTG-3'，Antisense5'-GGTCTCAAACATGATCTGGG-3'，片段317bp。PCR產(chǎn)物各20μl，在10g/L瓊脂糖凝膠中電泳分離，溴化乙錠染色并在紫外燈下顯影拍照。 7.免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2蛋白陽(yáng)性率：采用A

12、PAAP法，具體染色步驟參照試劑盒說(shuō)明。陽(yáng)性結(jié)果為胞漿內(nèi)出現(xiàn)紅色顆粒，油鏡下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 8.用透射電鏡觀察自噬、凋亡細(xì)胞變化。 9.細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析及核的變化：收集As2O3處理24h、48h的兩種細(xì)胞，用相差顯微鏡觀察并拍照。核的改變觀察用70％冷乙醇將細(xì)胞固定于4℃過(guò)夜，PBS洗滌50g·ml-1含0.1％Triton-100，0.1MEDTAPI室溫染色30min，同時(shí)加入100U·ml

13、-1的RNA酶，上流式細(xì)胞儀分析。 10.統(tǒng)計(jì)處理：相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析。數(shù)據(jù)以x±s表示；兩樣本均數(shù)之間的比較，采用t檢驗(yàn)。以上各種檢驗(yàn)中，以0.05為顯著性水平界值。采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 研究結(jié)果： 1.As2O3對(duì)HepG-2、HL60、K562細(xì)胞的影響：顯微鏡下觀測(cè)對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，成簇分布，細(xì)胞數(shù)目較多，胞質(zhì)透明。經(jīng)不同濃度As2O3作用24小時(shí)后，三種細(xì)胞數(shù)

14、目顯著減少，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞胞漿混濁。 2.三種細(xì)胞自噬水平改變：自噬泡的本質(zhì)是自噬溶酶體，MDC可染色于自噬特征性的自噬泡上而成為自噬的特異性染料。而熒光顯微鏡下所見(jiàn)腫瘤細(xì)胞MDC著染增強(qiáng)即為自噬泡積聚的表現(xiàn)。在各As2O3處理組，MDC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加，每個(gè)細(xì)胞中自噬泡數(shù)量也較多。而對(duì)照組細(xì)胞，僅見(jiàn)到很少量的MDC陽(yáng)性細(xì)胞，并且每個(gè)細(xì)胞中含的自噬泡數(shù)量也很少；流式細(xì)胞術(shù)定量測(cè)定各處理組MDC陽(yáng)性細(xì)胞百分率隨As2O3濃度增

15、加而遞增，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別P＜0.05，P＜0.01=。 3.As2O3誘導(dǎo)凋亡：用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度As2O3作用24h、48h引起的凋亡比例。K562細(xì)胞在As2O3濃度低時(shí)的凋亡比例很低，只有當(dāng)濃度很高時(shí)，才出現(xiàn)明顯的凋亡。 4.As2O3對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2基因轉(zhuǎn)錄水平的影響：Bcl-2陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，主要位于細(xì)胞漿，染色強(qiáng)度強(qiáng)弱不一，分布也不規(guī)則。對(duì)照組及

16、各處理組均可檢測(cè)到Bcl-2蛋白表達(dá)，各處理組平均Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨As2O3濃度上升而下降，且與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。 5.細(xì)胞自噬同Bcl-2基因表達(dá)的關(guān)系：經(jīng)相關(guān)性分析，細(xì)胞自噬水平與Bcl-2蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.63，P＜0.05)。 6.K562細(xì)胞自噬現(xiàn)象的透射電鏡觀察電鏡下可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡積聚及膨脹的線粒體。 7.As2O3引起三種細(xì)

17、胞形態(tài)和核的變化：As2O3作用24h后，電鏡下出現(xiàn)細(xì)胞自噬的特征變化，可見(jiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬泡積聚及膨脹的線粒體。As2O3作用48h后，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的特征，可見(jiàn)細(xì)胞體積縮小，胞漿濃縮，胞核體積減小，可裂解成一個(gè)或數(shù)個(gè)致密體，可見(jiàn)核小體碎裂，核染色質(zhì)聚集或邊集，部分染色質(zhì)致密成斑塊狀或沿核膜收縮成新月體狀，整個(gè)細(xì)胞可裂解成大小不一的凋亡小體。 研究結(jié)論： 1.三氧化二砷可誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞、HL-60細(xì)胞及K562細(xì)胞