三氧化二砷對急性早幼粒細(xì)胞白血病NB4細(xì)胞株Warburg效應(yīng)的影響和機制.pdf

1、第一部分白血病細(xì)胞株中Warburg效應(yīng)的探討
　　目的:檢測白血病細(xì)胞株中是否存在Warburg效應(yīng)。
　　方法:糖酵解抑制劑(2-DG)和氧化磷酸化抑制劑(oligomycinA:OA)分別作用于THP-1、K562、HL-60和NB4細(xì)胞株48h,采用MTT檢測細(xì)胞的生長抑制率。乳酸測定試劑盒和葡萄糖測定試劑盒測定各細(xì)胞株在低血清的RPMI1640中葡糖糖的消耗和乳酸生成,及其兩者的比值。
　　結(jié)果:白血病細(xì)胞株

2、的生長抑制對2-DG呈濃度依賴性,不同濃度的2-DG干預(yù)48h后發(fā)現(xiàn)NB4和HL-60細(xì)胞的生長抑制較明顯,K562對2-DG作用不敏感。白血病細(xì)胞株的生長抑制對OA不成濃度依賴性,OA作用后48h后發(fā)現(xiàn)THP-1對OA敏感性較高,K562和NB4對OA敏感性較低。NB4對葡糖糖的攝取較其它細(xì)胞株更顯著,且消耗的葡萄糖/生成的乳酸比值≈1/2。
　　結(jié)論:NB4對糖酵解的抑制劑作用最敏感,且消耗的葡萄糖/生成的乳酸比值≈1/2,提

3、示NB4的Warburg效應(yīng)異常顯著。
　　第二部分三氧化二砷在NB4中對miRNA-122的調(diào)節(jié)作用
　　目的:檢測三氧化二砷和全反式維甲酸作用于急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系NB4細(xì)胞后miRNA-122的表達(dá)變化。
　　方法:采用實時定量PCR檢測藥物干預(yù)前后miRNA-122的表達(dá)。
　　結(jié)果:1μmol/LATO和1μmol/L的ATRA作用于NB448h,實時定量PCR檢測結(jié)果表明,ATO作用后miRNA

4、-122的表達(dá)增高了4倍,ATRA作用后miRNA-122表達(dá)增高了1.2倍。
　　結(jié)論:相同藥物濃度作用下,ATO更能促進(jìn)miRNA-122的表達(dá)。
　　第三部分PKM2是miRNA-122靶基因
　　目的:證實PKM2為miRNA-122靶基因,抑制miR-122能夠解除對PKM2的負(fù)調(diào)控導(dǎo)致PKM2表達(dá)升高。
　　方法:采用TargetScanHuman5.1軟件預(yù)測miRNA-122和PKM2的結(jié)合位點,

5、設(shè)計調(diào)取PKM23’UTR的引物序列和野生突變PKM23’UTR并擴增,將擴增的序列和psiCHECK-2載體連接并轉(zhuǎn)化,采用陽離子脂質(zhì)體法對轉(zhuǎn)化質(zhì)粒和miR-122模擬物、抑制劑和陰性對照分別共轉(zhuǎn)染NB448小時后收集細(xì)胞,采用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)對熒光素酶的活性進(jìn)行檢測。構(gòu)建攜帶miR-122inhibitor的慢病毒并轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞,用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)的NB4-mir-122inhibitor和NB4-NCinhititor細(xì)胞

6、系,并利用實時定量PCR檢測miR-122的表達(dá)。采用MTS和WesternBlot檢測抑制miR-122表達(dá)后細(xì)胞PKM2的表達(dá)以及細(xì)胞的增殖能力。
　　結(jié)果:PKM23’UTR質(zhì)粒與miR-122共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降有顯著差異,mutPKM23’UTR-1質(zhì)粒與miR-122共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降無統(tǒng)計學(xué)差異,mutPKM23’UTR-2與miR-122共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降有顯著差異,mutPKM23’UTR-3(同

7、時突變兩個預(yù)測結(jié)合位點)與miR-122共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性下降無統(tǒng)計學(xué)差異。成功構(gòu)建并篩選出NB4-mir-122inhibitor和NB4-NCinhititor細(xì)胞系,通過檢測發(fā)現(xiàn)抑制miR-122表達(dá)后細(xì)胞PKM2的表達(dá)升高,細(xì)胞的增殖能力增強。
　　結(jié)論:實驗通過雙熒光素酶和蛋白水平證實PKM2是miRNA-122特異的靶基因,PKM2和miRNA-122兩處結(jié)合位點中,第一處結(jié)合位點起關(guān)鍵作用,第二處結(jié)合位點起協(xié)助作用