亞硒酸鈉誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病NB4細(xì)胞凋亡作用機(jī)制研究.pdf

1、本文針對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)人急性早幼粒白血病NB4.細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Bcl-2家族成員的作用機(jī)制以及MAPK/Akt等上游蛋白激酶通路的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，并在研究中取得以下結(jié)果。 在20 μ M亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡過(guò)程中，伴隨有NB4細(xì)胞線粒體膜電位的降低，細(xì)胞色素C由線粒體向細(xì)胞質(zhì)的釋放，應(yīng)用caspase 9抑制劑z-LEHD-fmk可以有效抑制亞硒酸鈉誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在NB4細(xì)胞凋亡過(guò)程

2、中，抗凋亡蛋白Bcl-xL含量下降，促凋亡蛋白Bax和Bak蛋白水平均顯著上調(diào)，而且Bax在凋亡晚期可以被切割產(chǎn)生18 kD的切割產(chǎn)物。提取細(xì)胞線粒體發(fā)現(xiàn)線粒體上的Bax，Bak含量隨凋亡的進(jìn)行而增加，發(fā)生了線粒體轉(zhuǎn)位，DSS交聯(lián)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Bax發(fā)生了同源二聚化。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)NB4細(xì)胞中的Bax水平可以有效抑制凋亡的進(jìn)行。Bad蛋白水平發(fā)生上調(diào)，而B(niǎo)ad的Ser 112和Ser 136的磷酸化修飾發(fā)生下調(diào)。Bid蛋白在凋亡晚期明

3、顯下調(diào)，但未發(fā)現(xiàn)明顯的切割反應(yīng)，caspase 8抑制劑z-IETD-fmk對(duì)亞硒酸鈉誘發(fā)的凋亡影響不顯著。同時(shí)還檢測(cè)了Bcl-2 Ser 70的磷酸化水平的改變。以上結(jié)果說(shuō)明，在亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，內(nèi)源性線粒體凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮了重要的作用，Bcl-2家族成員Bax，Bak，Bad，Bcl-xL在此凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)中發(fā)揮有重要的作用。 在對(duì)MAPK家族中的主要成員(Erk，p38 MAPK，JNK)研究

4、時(shí)發(fā)現(xiàn)，20 μ M亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Erk和JNK活性隨亞硒酸鈉誘導(dǎo)時(shí)間的增加而逐漸降低，而p38 MAPK的活性則由24小時(shí)起顯著升高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Erk信號(hào)通路幾種上下游信號(hào)分子活性同時(shí)改變：MEK活性下調(diào)，p90 RSK活性下調(diào)，Raf Ser 338磷酸化水平下調(diào)，證明在亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡過(guò)程中Erk信號(hào)通路的整體下調(diào)，說(shuō)明此通路起著重要作用。進(jìn)一步應(yīng)用特異性抑制劑PD98059，SB203580，SP60

5、0125預(yù)處理NB4細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，MEK抑制劑PD98059可以有效抑制亞硒酸鈉誘導(dǎo)的NB4凋亡，Erk激活劑TPA則可以促進(jìn)NB4細(xì)胞凋亡。而p38 MAPK抑制劑SB203580和JNK抑制劑SP600125對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡沒(méi)有顯著影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MEK抑制劑PD98059對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的影響和其加入的順序有關(guān)，僅在亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞以前加入PD98059會(huì)對(duì)NB4凋亡產(chǎn)生抑制作用，在此后加入的P

6、D98059反而促進(jìn)亞硒酸鈉誘導(dǎo)的NB4細(xì)胞凋亡。上述結(jié)果表明在亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，Erk發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，其活性在凋亡早期是促進(jìn)凋亡的，而在晚期是抑制凋亡的；本研究所設(shè)定的實(shí)驗(yàn)條件下，p38 MAPK和JNK對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用并不明顯，其對(duì)亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的長(zhǎng)期效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。在對(duì)Akt的研究中發(fā)現(xiàn)，20 μ M亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞可以引發(fā)Akt活性的迅速下調(diào)，其變化明顯早于上述

7、三種MAPK的變化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其上游信號(hào)激酶PDK1和下游底物Raf Ser 259磷酸化、Bad Ser 136和GSK-3 β Ser 9磷酸化水平均迅速發(fā)生下調(diào)，證明了在亞硒酸鈉誘發(fā)NB4細(xì)胞凋亡中Akt信號(hào)通路的整體下調(diào)，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)Akt信號(hào)通路中重要上游負(fù)調(diào)控蛋白PTEN Ser380的磷酸化水平下降。應(yīng)用P13K特異性抑制劑LY294002進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用LY294002作用NB4細(xì)胞就可以誘發(fā)NB4細(xì)胞發(fā)生凋亡，作

8、用呈現(xiàn)劑量依賴性：同時(shí)LY 294002可以加強(qiáng)亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的作用。應(yīng)用LY 294002抑制Akt活性可以下調(diào)Erk活性及Bad Ser 112磷酸化水平，同時(shí)顯著上調(diào)p38 MAPK和JNK活性，顯示了NB4細(xì)胞中不同激酶信號(hào)通路之間的交叉作用。根據(jù)上述結(jié)果可以推斷：Akt活性是人急性早幼粒白血病細(xì)胞株NB4細(xì)胞的存活所必需的，Akt活性下調(diào)將誘發(fā)NB4細(xì)胞走向細(xì)胞凋亡；Akt活性下調(diào)是亞硒酸鈉誘導(dǎo)NB4細(xì)胞凋亡的過(guò)程

9、中的一個(gè)非常重要的早期事件，Akt活性的下調(diào)隨后誘發(fā)了下游眾多凋亡事件，包括Erk活性下調(diào)，Bad Ser 112和Ser 136去磷酸化，p38 MAPK激活等一系列事件，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡。 同時(shí)，研究了Akt和Erk，p38 MAPK，JNK在不同濃度亞硒酸鈉作用NB4細(xì)胞中可能發(fā)揮的作用。結(jié)果顯示：在低濃度(5μM以下)的亞硒酸鈉作用下，Erk和Akt的活性都發(fā)生了上調(diào)，在高濃度(10 μ M以上)時(shí)亞硒酸鈉可以以濃度依賴