納米銀誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及其毒性機制研究.pdf

1、納米科技快速發(fā)展，納米材料相關(guān)產(chǎn)品不斷開發(fā)和廣泛應(yīng)用。由于納米銀具有獨特的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性，因此被廣泛應(yīng)用于光學(xué)、衛(wèi)生、保健、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，是目前商品化程度最高的納米材料之一。納米銀產(chǎn)品的不斷開發(fā)和應(yīng)用，人體可能直接接觸納米銀相關(guān)產(chǎn)品或者暴露于含納米銀的環(huán)境中，這可能對人體構(gòu)成潛在威脅。體內(nèi)研究顯示納米銀可以通過不同的途徑進入生物體，繼而跨越生物屏障分布到不同的組織器官，對機體產(chǎn)生一定的毒作用。體內(nèi)研究提示肝臟和肺臟可能是納米銀的蓄

2、積和作用靶器官。體外細胞研究表明，納米銀可以引起多種細胞產(chǎn)生細胞毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性和免疫毒性。目前，關(guān)于納米銀引起細胞毒性的作用機制還不是十分清楚，還有許多問題亟待解決。比如納米銀引起細胞毒作用與氧化應(yīng)激關(guān)系，納米銀的毒作用是由納米銀粒子還是其釋放的銀離子引起。
　　因此本研究選擇靶器官肺臟、肝臟來源的兩種細胞株作為研究對象，人肺癌細胞(A549)和人肝癌細胞（HepG2）。通過一系列研究比較納米銀對兩株細胞的毒效應(yīng)，并探討

3、氧化應(yīng)激與細胞毒作用關(guān)系，考察納米銀釋放的銀離子在細胞毒性中的作用，進一步研究其誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制。
　　1、納米銀表征與體外穩(wěn)定性研究:PVP包被納米銀經(jīng)透射電子顯微鏡(TEM)觀察，納米銀顆粒為球形，分散均勻，無團聚現(xiàn)象，平均粒徑為23.44±4.92 nm。馬爾文粒度分析儀測得使用不含血清的DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀平均水合粒徑為61.89 nm，而使用含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀平均水合粒徑為51.58

4、nm，表明納米銀顆粒在培養(yǎng)液中有團聚現(xiàn)象，血清有助于其分散。使用超純水、PBS和生理鹽水分散的納米銀在4℃、25C和37℃孵育48 h內(nèi)最大紫外吸收峰和水合粒徑都沒有改變，而使用DMEM培養(yǎng)液稀釋的納米銀溶液在4℃條件下分散穩(wěn)定，在25℃和37℃時出現(xiàn)明顯團聚現(xiàn)象，表明不同分散液、時間和溫度對納米銀體外分散都有影響。
　　2、納米銀對A549和HepG2細胞毒性研究:20～640μg/mL納米銀染毒A549和HepG2細胞24、4

5、8 h后，兩株細胞存活率均呈現(xiàn)時間和劑量依賴性下降;在相同染毒條件下，A549細胞存活率下降更加明顯。20～160μg/mL納米銀染毒兩株細胞24、48 h后可以引起細胞形態(tài)學(xué)改變，具體表現(xiàn)為:20、40μg/mL劑量下細胞形態(tài)沒有明顯變化;80、160μg/mL劑量下細胞間距增加、細胞皺縮變圓、漂浮細胞增加、細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡。細胞凋亡率檢測發(fā)現(xiàn)與對照組比較，染毒24 h后各劑量組A549細胞凋亡率變化無統(tǒng)計學(xué)意義，而各劑量組HepG2細

6、胞凋亡率均增加;染毒48 h后，40～160μg/mL劑量組A549細胞和160μg/mL劑量組HepG2細胞凋亡率均增加。使用5mmol/L N-乙酰半胱氨酸(NAC)預(yù)處理細胞2h后，與相應(yīng)染毒時間的160μg/mL劑量組比較，兩株細胞凋亡率均顯著下降。以上研究表明納米銀可以引起兩株細胞增殖抑制、形態(tài)學(xué)改變和凋亡率增加，這可能與細胞內(nèi)活性氧增加相關(guān)。
　　3、納米銀對A549和HepG2細胞氧化應(yīng)激作用研究:脂質(zhì)過氧化檢測發(fā)現(xiàn)

7、80、160μg/mL劑量組A549細胞內(nèi)丙二醛(MDA)含量顯著增加;而各劑量組HepG2細胞內(nèi)MDA含量都沒有顯著增加。超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽(GSH)含量檢測發(fā)現(xiàn)，納米銀染毒A549細胞24h后，SOD活力沒有明顯改變，GSH含量上升;染毒48 h后，SOD活力和GSH含量在40～160μg/mL劑量組下降。納米銀染毒HepG2細胞24、48 h后，SOD活力和GSH含量都表現(xiàn)為上升。此外，納米銀染毒兩株細胞48

8、h后，細胞內(nèi)應(yīng)激蛋白Hsp70和HO-1表達都增加。以上研究表明納米銀可以引起A549細胞發(fā)生更明顯的脂質(zhì)過氧化，這可能與兩株細胞內(nèi)不同的氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。
　　4、細胞攝取納米銀定量及其分布研究:通過電感耦合等離子體質(zhì)譜檢測細胞攝取的銀含量，結(jié)果顯示納米銀染毒兩株細胞24、48 h后，細胞攝取銀含量都呈現(xiàn)劑量依賴性增加，但沒有時間依賴性。表現(xiàn)為低劑量時(20μg/mL)24 h細胞攝取的銀含量小于48 h;高劑量時(80、160

9、μg/mL)24 h細胞攝取的銀含量大于48 h。通過超速離心加超濾法分離染毒液銀離子和細胞內(nèi)銀離子發(fā)現(xiàn)，使用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液分散的納米銀溶液在0h時，銀離子含量呈劑量依賴性增加，其中160μg/mL染毒液銀離子釋放最多，約為37 ng/mL;于37℃孵育24、48 h后，只有在160μg/mL染毒液能檢測到微量銀離子。細胞內(nèi)銀離子含量檢測發(fā)現(xiàn)A549細胞內(nèi)銀離子含量呈現(xiàn)時間和劑量依賴性增加，而HepG2細胞只呈現(xiàn)劑量依

10、賴性增加。硝酸銀染毒兩株細胞后發(fā)現(xiàn)相同銀含量的硝酸銀對兩株細胞活力影響大于納米銀。經(jīng)TEM檢測發(fā)現(xiàn)，納米銀顆粒可以通過胞吞途徑進入細胞，主要分布在A549細胞的細胞質(zhì)和溶酶體中;在HepG2細胞的細胞質(zhì)、細胞核和溶酶體中。研究表明兩株細胞可以通過胞吞途徑攝取銀顆粒，并在細胞內(nèi)釋放銀離子，進而引起細胞毒性。
　　5、納米銀誘導(dǎo)A549和HepG2細胞凋亡機制研究:納米銀染毒A549和HepG2細胞48 h后，Western Blot

11、ting檢測發(fā)現(xiàn)A549和HepG2細胞內(nèi)Cytochrome C、AIF、Caspase3、Caspase8和Caspase9蛋白表達水平均顯著升高，Bcl-2/Bax的比值顯著降低。結(jié)果表明納米銀誘導(dǎo)兩株細胞凋亡涉及線粒體途徑和死亡受體途徑。
　　綜上所述，納米銀對A549和HepG2細胞具有一定的細胞毒性。兩株細胞在40～160μg/mL濃度下48 h，A549細胞比HepG2細胞顯示更明顯的增殖抑制和凋亡。納米銀可以通過胞