納米銀肝細胞毒性效應及凋亡機制研究.pdf

1、納米科技的不斷發(fā)展，納米材料廣泛地應用于人們日常生活中，而納米銀作為一種新型抗菌材料，是目前商品化程度最高的納米材料之一，被廣泛地應用于衛(wèi)生、保健、醫(yī)學等領域。納米銀產品不斷地開發(fā)和應用，生物體頻繁暴露于金屬銀的環(huán)境中，所受到的潛在生物安全性威脅也隨之增大，因此納米銀的生物安全性定量評估亟待解決。已有的研究顯示納米銀可以通過不同的途徑進入生物體，進而隨著血液循環(huán)到達新陳代謝活躍的器官，多數(shù)研究表明納米銀的蓄積和作用靶器官是肝臟。本課題組

2、先前的小鼠急性毒性試驗和體內動力學研究也顯示，納米銀進入體內可廣泛分布于全身各組織器官，而肝臟和脾臟是納米銀蓄積和作用的靶器官。然而體內研究并未對納米銀毒作用機制給出更多解釋。體外細胞研究表明，納米銀細胞毒性效應主要表現(xiàn)為降低細胞活力，損傷細胞膜，誘導氧化應激，影響炎癥因子分泌，改變細胞間隙連接通訊，損傷DNA，以及誘導細胞凋亡等。由于大多數(shù)研究所用的細胞類型不同，納米銀材料特性如粒徑大小、表面修飾等的差異，所以對于納米銀細胞毒性的產生

3、機制尚無比較明確一致的解釋。此外最近一些研究發(fā)現(xiàn)，納米銀對腫瘤細胞的生長有較明顯的增殖抑制作用。因此本研究選擇靶器官肝臟來源的兩種細胞株作為研究對象，人肝癌細胞株HepG2細胞和人正常肝細胞株L02細胞，通過一系列研究比較納米銀對兩種細胞的毒性效應差異，進一步探討其毒性作用機制，為納米銀的生物安全性評價以及在生物醫(yī)藥領域的應用奠定基礎。
　　為了更好的研究市場化納米銀的毒理學效應，反映人們實際接觸的納米銀材料可能具有的潛在威脅，本

4、研究使用商品化的納米銀材料，平均粒徑為(23.44±4.92 nm)，表面由聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)包被，比較納米銀對HepG2細胞和L02細胞毒性效應的差異，包括細胞活力、細胞膜損傷、細胞形態(tài)的改變以及細胞內納米銀的分布等，并尋找納米銀對兩株細胞毒性效應差異的劑量范圍，在此劑量下研究探討納米銀誘導肝細胞凋亡的分子機制。
　　1、納米銀材料表征以及細胞培養(yǎng)液中離子動力學研究:①市售納米銀為PVP包被的納米銀材料，通過透射電鏡(T

5、EM)和掃描電鏡(SEM)觀察，納米銀顆粒形態(tài)為球形，平均粒徑為(23.44±4.92 nm)，在細胞培養(yǎng)液中分散均勻，無團聚現(xiàn)象。②馬爾文粒徑分析儀測得納米銀在細胞培養(yǎng)液中的水合粒徑為43.76nm。③在16.0 mg/ml的納米銀-細胞培養(yǎng)液分散液中所釋放的銀離子濃度幾乎可以忽略，且0～48h內釋放的銀離子水平相對穩(wěn)定，為后續(xù)細胞活力實驗奠定基礎。
　　2、納米銀對HepG2細胞和L02細胞活力影響研究:①比較了MTT和CCK

6、-8兩種方法對納米銀暴露細胞活力測定的影響，發(fā)現(xiàn)兩種方法對兩種肝細胞的細胞活力測定結果基本一致。在較低劑量(20、40、80、160μg/ml)下納米銀對兩株細胞的細胞活力影響差異具有統(tǒng)計學意義，且染毒24h后，20～80μg/ml納米銀可增強L02細胞活性，而對HepG2產生明顯的細胞毒性;而染毒48h后，納米銀對兩種細胞的生長增殖均有一定抑制作用，隨著納米銀染毒劑量增大，細胞活性逐漸降低，表現(xiàn)出明顯的時間-劑量效應。②在CCK-8方

7、法中選擇兩組銀離子對照，分別為高速離心法獲得的不同濃度的銀離子溶液以及硝酸銀溶液。結果表明硝酸銀的細胞毒性遠遠高于納米銀，而納米銀所釋放的銀離子濃度與納米銀本身劑量有關，只有640μg/ml的納米銀溶液中所釋放的銀離子對兩株細胞產生了一定的毒性效應。而PVP溶液組，對兩株細胞活力均無明顯影響。故推論納米銀對細胞的生物學效應主要是納米銀單體發(fā)揮作用。③LDH法測定細胞膜損傷，結果表明20～160μg/ml納米銀誘導對肝細胞的細胞膜損傷具有

8、時間-劑量效應，且HepG2細胞釋放的LDH活力明顯高于L02細胞，與MTT及CCK-8測定結果相一致。表明納米銀暴露對兩株細胞具有不同的毒性效應，在相同劑量下，HepG2細胞比L02細胞對納米銀更加敏感。
　　3、納米銀對HepG2細胞和L02細胞形態(tài)的影響及納米銀在細胞內的分布研究:①倒置顯微鏡觀察不同劑量下(0、20、40、80、160μg/ml)納米銀暴露24h或48h后HepG2細胞和L02細胞的細胞形態(tài)。HepG2細胞

9、形態(tài)明顯改變，皺縮變圓，數(shù)目減少，而L02細胞形態(tài)基本保持正常，有少量細胞收縮，細胞間距離變大，不再聚集生長。②TEM觀察高劑量(160μg/ml)納米銀染毒肝細胞，發(fā)現(xiàn)納米銀引起兩株細胞膜破壞，胞內空泡化增多，核內染色質凝聚邊集在核膜周圍，線粒體腫脹，嵴消失或斷裂，內質網擴張。③TEM高倍鏡下觀察納米銀在細胞內的分布，發(fā)現(xiàn)染毒24h在細胞膜周圍分散著納米銀顆粒，而染毒48h后，可在細胞胞質內觀察到納米銀顆粒，細胞核內無發(fā)現(xiàn)。HepG2

10、細胞的線粒體有黑色顆粒沉著，而L02細胞可在溶酶體和內吞小泡中發(fā)現(xiàn)黑色顆粒。納米銀染毒后引起兩株細胞的形態(tài)改變不同，在細胞內的分布也具有差異。
　　4、流式細胞術測定納米銀誘導HepG2細胞和L02細胞凋亡機制研究:①納米銀可誘導兩株細胞早期凋亡率升高及線粒體膜電位下降，都具有時間-齊劑量依賴效應。比較HepG2細胞和L02細胞暴露相同時間，相同劑量的納米銀分散液，可發(fā)現(xiàn)20～160μg/ml納米銀暴露24h或48h，HepG2細

11、胞的早期凋亡率和線粒體膜電位下降率均明顯高于L02細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，P＜0.01)。并且L02細胞在納米銀暴露24h后，其早期凋亡率和線粒體膜電位下降率均低于10％，即納米銀對L02細胞毒性較小，再次驗證細胞活力實驗結果。②細胞ROS產生實驗發(fā)現(xiàn)，納米銀誘導HepG2細胞ROS的產生具有劑量和時間效應;而對L02細胞，無論是染毒24h還是48h，其ROS水平均沒有顯著升高。因此認為納米銀誘導HepG2細胞凋亡與氧化

12、應激有關，并且納米銀所誘導的HepG2細胞毒性高于L02細胞可能也與此相關。以上研究表明，納米銀誘導HepG2細胞毒性的可能機制是納米銀誘導氧化應激反應，引起ROS產生，促使線粒體膜電位下降，進而誘導細胞早期凋亡。而對于L02細胞可能需要更高的劑量方可誘導相似的凋亡作用。
　　5、納米銀誘導HepG2細胞凋亡的分子機制:Western Blotting測定HepG2細胞中凋亡相關蛋白的表達，結果表明納米銀誘導HepG2細胞凋亡機制

13、可能與線粒體途徑和腫瘤壞死受體途徑有關。其中Cyt C、Caspase3、Caspase8和Caspase9蛋白水平隨著劑量升高均明顯升高，抗凋亡蛋白分子Bcl-2與促凋亡蛋白分子Bax的比值以及NF-κB蛋白表達水平隨著劑量升高逐漸降低。
　　綜上所述，納米銀對HepG2細胞和L02細胞具有一定的細胞毒性，且納米銀誘導的細胞毒性主要是由納米銀單體發(fā)揮作用。在實驗研究劑量下(20～160μg/ml)兩株細胞表現(xiàn)出不同的細胞毒性效應

14、，HepG2細胞比L02細胞對納米銀更加敏感。造成兩株細胞毒性差異的原因可能是納米銀誘導HepG2細胞產生ROS，而L02細胞卻沒有激發(fā)產生ROS，兩株細胞早期凋亡率、線粒體膜電位下降率均顯示具有顯著差異性。通過對HepG2細胞凋亡相關蛋白表達的測定，表明納米銀誘導HepG2細胞凋亡與線粒體依賴途徑和腫瘤壞死受體途徑有關。因此，納米銀對HepG2細胞毒性作用的機制可能是:納米銀引起HepG2細胞內ROS水平上升，線粒體膜電位降低，使得線