與 SmpB 蛋白相結(jié)合的特異肽適體 PA-1的篩選及其降低維氏氣單胞菌毒力的分子機(jī)制研究.pdf

1、維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)是一種重要的人-魚共患致病菌，廣泛存在于各種水體、淤泥和土壤環(huán)境中，能夠感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，同時也能夠引起免疫力低下患者急性腹瀉、敗血癥、腦膜炎等，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，對人類健康也構(gòu)成威脅。但迄今為止，關(guān)于維氏氣單胞菌疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)研究還很薄弱。為此，本研究采用細(xì)菌雙雜交、分子克隆、實(shí)時熒光定量PCR、細(xì)菌單雜交等技術(shù)，以維氏氣單胞菌滯留核糖體拯救主要伴侶蛋白Small pr

2、otein B（SmpB）為靶標(biāo)，對與其相結(jié)合的特異性肽適體及其作用機(jī)制等進(jìn)行了研究，所獲得主要研究結(jié)果具體如下：
　　1、與SmpB蛋白相結(jié)合的高特異、高親和力肽適體的篩選與鑒定。采用細(xì)菌雙雜交技術(shù)，從金黃色葡萄球菌核酸酶（SNase）為骨架蛋白構(gòu)建的肽適體文庫中篩選出與SmpB蛋白高特異、高親和力結(jié)合的肽適體PA-1。誘導(dǎo)表達(dá)SmpB、骨架蛋白SNase和肽適體PA-1蛋白，利用酶聯(lián)免疫的方法，證實(shí)肽適體PA-1與SmpB在體

3、外具有結(jié)合特異性，其解離常數(shù)（dissociation constant）Kd值為0.69μM，相比SN結(jié)合SmpB的Kd1.380μM，具有更高的親和力。SmpB N-端34以及C端30氨基酸殘基，與肽適體PA-1表面突環(huán)有很強(qiáng)的相互作用，其中SmpB與肽適體PA-1相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)為T14I15、F26I27和D138K139R140。
　　2、基于肽適體PA-1的維氏氣單胞菌減毒株的構(gòu)建及功能研究。利用細(xì)菌雙親接合，將肽適

4、體骨架蛋白SN的表達(dá)質(zhì)粒pN-SN、肽適體PA-1表達(dá)質(zhì)粒pN-PA-1及空載體pRE112導(dǎo)入維氏氣單胞菌。結(jié)果顯示，與野生型或轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒相比較，導(dǎo)入質(zhì)粒pN-PA-1的維氏氣單胞菌生長十分緩慢，在0.0％-5.0% NaCl，2.5 mM CaCl2和25 mM MgCl2存在下非常敏感。斑馬魚（Danio rerio）半致死濃度LD50分析結(jié)果表明，含PA-1表達(dá)質(zhì)粒(pN-PA-1)的A. veronii C4較野生型毒力降低約

5、33倍；腹腔注射免疫斑馬魚，酶聯(lián)免疫法檢測到IgM抗體在14天時達(dá)到最高，并持續(xù)到28天；在攻毒實(shí)驗(yàn)中，免疫組表現(xiàn)出65%的相對免疫保護(hù)率，具備減毒活疫苗的特性。由此說明，肽適體PA-1可導(dǎo)致維氏氣單胞菌毒力水平顯著下降，對減毒活疫苗的研發(fā)具有重要的指導(dǎo)意義。
　　3、肽適體PA-1導(dǎo)致維氏氣單胞菌毒力水平下降的分子機(jī)制研究。采用實(shí)時熒光定量PCR檢測外膜蛋白o(hù)mpA、toloC基因、氣溶素aer基因等的轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果顯示，各

6、維氏氣單胞菌中smpB基因轉(zhuǎn)錄水平基本不變，而導(dǎo)入PA-1的維氏氣單胞菌ompA等毒力基因轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)。提示，PA-1可能與維氏氣單胞菌 SmpB 為了進(jìn)一步探討 SmpB是否可以調(diào)控上述表達(dá)下調(diào)基因的表達(dá)，本研究選取 ompA基因進(jìn)行研究。通過細(xì)菌單雜交以及凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)證實(shí)SmpB可以作為轉(zhuǎn)錄因子高親和力結(jié)合在外膜蛋白o(hù)mpA啟動子區(qū)，DNA足跡法顯示SmpB蛋白結(jié)合在ompA啟動子的-35區(qū)上游，且在Mg2+輔助下促進(jìn)

7、ompA轉(zhuǎn)錄，維持細(xì)菌毒力水平，細(xì)菌雙雜交顯示SmpB蛋白和外膜蛋白OmpA沒有相互作用。由此說明，SmpB可能作為一種轉(zhuǎn)錄因子參與對 ompA表達(dá)的調(diào)控。
　　綜上所述，本研究主要發(fā)現(xiàn)一種新的與維氏氣單胞菌SmpB蛋白相結(jié)合的肽適體PA-1，其可通過阻遏SmpB蛋白功能的發(fā)揮下調(diào)ompA等相關(guān)基因的表達(dá)而導(dǎo)致維氏氣單胞菌生存能力以及毒力水平的下降。所獲研究結(jié)果為開發(fā)維氏氣單胞菌減毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)，并對以SmpB為抑菌靶標(biāo)，開發(fā)