假交替單胞菌胞外產(chǎn)物的特性分析及其抑菌蛋白的克隆與表達(dá).pdf

1、第一部分益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用
　　水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，病害頻發(fā)，利用益生菌來改善生態(tài)環(huán)境、預(yù)防治療水產(chǎn)動物疾病已經(jīng)越來越得到認(rèn)可。本部分對水產(chǎn)益生菌的定義、水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用益生菌種類以及益生菌的作用機(jī)制簡單概述，并介紹了假交替單胞菌屬，該屬能夠分泌多種生物活性物質(zhì)，包括小分子化合物、蛋白質(zhì)、多糖等，在水產(chǎn)病害防治、赤潮防治等方面具有較大的潛力。
　　第二部分假交替單胞菌m8和a22胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物抑菌活性比較
　　

2、本部分運(yùn)用玻璃紙覆蓋平板法制備實驗菌株的胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物，通過濾紙片法檢測胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物的抑菌活性，結(jié)果表明胞外產(chǎn)物和胞內(nèi)產(chǎn)物對副溶血弧菌都有抑制作用，且胞外產(chǎn)物的抑菌效果要好于胞內(nèi)產(chǎn)物。為了優(yōu)化制備胞外產(chǎn)物的培養(yǎng)時間，分別于培養(yǎng)12h、24 h、36 h和48h后制備胞外產(chǎn)物，然后用濾紙片法進(jìn)行抑菌活性檢查，并對各個時間制備的胞外產(chǎn)物總蛋白含量進(jìn)行定量。結(jié)果表明，培養(yǎng)24h后制備胞外產(chǎn)物的抑菌活性最好且總蛋白含量在24h也達(dá)到最

3、大值。
　　第三部分假交替單胞菌m8和a22胞外產(chǎn)物相關(guān)性質(zhì)研究
　　將過氧化氫酶濃度設(shè)為三個梯度，分別為100μg/mL，200μg/mL，500μg/mL，測試了過氧化氫酶對胞外產(chǎn)物抑菌活性的影響。結(jié)果顯示過氧化氫酶能夠抑制胞外產(chǎn)物的抑菌活性，含有過氧化氫酶的濾紙片能夠使抑菌圈產(chǎn)生缺口，但可能是濾紙片距離擺放的原因，不同濃度的過氧化氫酶產(chǎn)生缺口并沒有明顯的差異。L-氨基酸氧化酶能夠催化氨基酸釋放過氧化氫而產(chǎn)生抑菌作用，但

4、它們的底物多種多樣。用修改后的分光光度計法檢測過氧化氫的產(chǎn)生量，將20種L-氨基酸分別作為底物，在505nm下測吸光值。結(jié)果顯示， L-賴氨酸作為底物產(chǎn)生過氧化氫的量高于其他L-氨基酸，菌株m8的胞外蛋白添加L-賴氨酸產(chǎn)生過氧化氫量高于a22，這與m8的抑菌活性好于a22相對應(yīng)，推測通過產(chǎn)生過氧化氫來產(chǎn)生抑菌活性。通過變性聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）及膠內(nèi)活性檢測，發(fā)現(xiàn)分子量為70KDa的蛋白條帶具有抑菌活性，在膠條上形成明顯

5、的抑菌條帶，并將該條帶切下來進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果表明，菌株 m8的70KDa蛋白條帶鑒定為 TonB-dependent receptor[Pseudoalteromonas flavipulchra JG1]，菌株a22的70KDa蛋白條帶鑒定為抗菌蛋白antibacterial protein[Pseudoalteromonas flavipulchra JG1]。
　　第四部分菌株a22抑菌蛋白的克隆與表達(dá)
　　根據(jù)Ge

6、neBank公布的抑菌蛋白的序列，用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物，以菌株基因組DNA為模板擴(kuò)增目的基因，將純化后的目的基因與表達(dá)載體pBAD/gⅢA連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21，構(gòu)建重組表達(dá)菌株 BL21/pBAD/gⅢA/2-p-1，在20℃用終濃度為0.5％L-阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過S DS-PAGE顯示該蛋白能在大腸桿菌中異源表達(dá)，但是表達(dá)產(chǎn)物的可溶部分并未檢測到抑菌活性，推測可能是形成了包涵體，無法進(jìn)