嗜水氣單胞菌彈性蛋白酶性質(zhì)分析及其克隆表達(dá).pdf

1、彈性蛋白酶是一種以降解不溶性彈性蛋白為特征的廣譜水解蛋白酶。其用途廣泛：可作為生化用藥；用于食品及化妝品工業(yè)；處理污水等。該酶產(chǎn)品的生產(chǎn)一般由豬胰臟提取，受動(dòng)物臟器資源的限制，彈性蛋白酶價(jià)格昂貴。而微生物生產(chǎn)的彈性蛋白酶具有產(chǎn)率高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)條件易于控制等優(yōu)點(diǎn)，頗有發(fā)展前途。 1.對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素法優(yōu)化了氮源、碳源等培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)溫度和初始pH值等培養(yǎng)條件，采用三因素三水平的正交試驗(yàn)對(duì)氮源

2、濃度、碳源濃度、鹽離子濃度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低濃度的氮源、碳源有利于酶的產(chǎn)生，表面活性劑能明顯提高酶的產(chǎn)量。嗜水氣單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶的最佳條件：胰蛋白胨5g／L，蔗糖5g／L，NaCl 2.5g／L，K<,2>HPO<,4>2g／L，Tween-80活性劑1g／L，初始pH為7.5，28℃培養(yǎng)48h。 2.用10kDa的截流膜超濾，30-60％的硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠過濾層析和陰離子交換層析，獲得純化的嗜水氣單胞菌胞外彈性蛋白酶

3、，SDS-PAGE電泳顯示，該酶是分子量約為33kDa的單體蛋白。該彈性蛋白酶的最適作用pH8.5，最適作用溫度為37℃，有廣譜的底物降解能力，能降解彈性蛋白、酪蛋白、明膠、牛血清白蛋白，但不能降解角蛋白；EDTA、OPA能抑制酶的活性，PMSF對(duì)酶活沒有影響，表明該蛋白酶屬于Zn<'2+>／Fe<'2+>金屬蛋白酶。 3.用活化的右旋糖酐及單甲氧聚乙二醇(MPEG)分別對(duì)純化的嗜水氣單胞菌彈性蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾。修飾后的酶與原

4、酶相比，修飾酶保留了天然酶的活性，兩種修飾酶活性均能保留在60％以上，用MPEG修飾酶的保留活性更高(85.5％)，而且兩種修飾酶在耐熱性、耐酸性等方面都優(yōu)于天然酶，但修飾酶最佳pH沒變。修飾酶較天然酶穩(wěn)定，具有較高的實(shí)用意義。 4.根據(jù)GenBank嗜水氣單胞菌AG2株彈性蛋白酶基因(AhyB)設(shè)計(jì)一對(duì)含EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切位點(diǎn)的特異引物，以嗜水氣單胞菌J-1(AhJ-1)株基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到一 787bp

5、的基因片斷，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，測(cè)序，分析發(fā)現(xiàn)與嗜水氣單胞菌AG2彈性蛋白酶(ahyB)基因有92％同源性，與豚鼠氣單胞菌胞外蛋白酶同源性達(dá)95％，與銅綠假單胞菌LasB基因同源性為81％。然后將PCR產(chǎn)物連入表達(dá)載體pET-32a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株中用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后出現(xiàn)50kDa的融合表達(dá)產(chǎn)物，產(chǎn)物以包涵體形式出現(xiàn)；用His TaqNi<'2+>親和層析柱在變性條件下純化該表達(dá)蛋白；純化蛋白復(fù)