金麗假交替單胞菌JG1抑菌機(jī)理研究.pdf

1、假交替單胞菌（Pseudoalteromonas）廣泛分布于世界各地的海洋環(huán)境中，可分為產(chǎn)色素或不產(chǎn)色素兩大類，其中產(chǎn)色素菌株的顯著特征是能夠形成具有多種不同生物活性的代謝產(chǎn)物，如抗細(xì)菌、抗真菌、溶藻等活性。目前已從該屬菌株中分離純化出多種具有抑菌活性的小分子化合物、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)，而對該屬菌株基因組的分析也已成為研究其多種生物活性物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制及對不同海洋環(huán)境適應(yīng)性的重要手段。因此，對該屬菌株抑菌機(jī)理的研究有助于開發(fā)新型的有益菌制劑

2、和海洋藥物，從而廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害、生物污損及赤潮等的防治中。本論文分離純化了金麗假交替單胞菌（Pseudoalteromonas flavipulchra）JG1所產(chǎn)生的多種抑菌物質(zhì)并對其抑菌機(jī)理進(jìn)行了初步探討，完成了該菌株的全基因組測序及分析，并對其適應(yīng)復(fù)雜的海洋環(huán)境并形成生存優(yōu)勢的能力進(jìn)行了闡釋，為后續(xù)對該菌株及其代謝產(chǎn)物的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。
　　金麗假交替單胞菌JG1分離自健康大菱鲆養(yǎng)殖海水，對多個(gè)種屬的菌株具有

3、較強(qiáng)的抑菌活性，如弧菌屬、芽孢桿菌屬等。通過石油醚﹑乙酸乙酯﹑正丁醇對JG1發(fā)酵液上清和菌體樣品進(jìn)行分步萃取，發(fā)現(xiàn)菌株JG1發(fā)酵液的石油醚層、乙酸乙酯層萃取樣品及水層樣品均具有抑菌活性。這表明JG1的抑菌物質(zhì)中既含有某些小分子物質(zhì)如脂類、糖類、色素類化合物，也包含有大分子蛋白類物質(zhì)，這兩類物質(zhì)協(xié)同作用產(chǎn)生更好的抑菌效果。
　　采用硫酸銨沉淀法、SDS-PAGE及電洗脫法對JG1的胞外蛋白進(jìn)行了分離純化，在SDS-PAGE中可見單一

4、條帶，且膠內(nèi)活性檢測表明該蛋白對鰻弧菌有較強(qiáng)的抑菌活性。將此抑菌蛋白經(jīng)De novo測序得到的兩條肽段的氨基酸序列與菌株JG1的蛋白質(zhì)組序列進(jìn)行比對，獲得其基因及氨基酸序列全長，并將其命名為PfaP。PfaP蛋白共由694個(gè)氨基酸組成，理論分子量為77.0 kDa，理論等電點(diǎn)為4.63，Signal P預(yù)測其不含有信號肽序列。氨基酸序列比對結(jié)果顯示，PfaP蛋白與被囊假交替單胞菌（P. tunicata）D2的L-賴氨酸氧化酶AlpP具

5、有58％的一致性，與地中海海洋單胞菌（Marinomonas mediterranea）MMB-1的抗微生物蛋白marinocine具有54%的一致性。由此推測PfaP蛋白為一種L-氨基酸氧化酶，其抑菌活性是由過氧化氫介導(dǎo)的，過氧化氫酶能夠抑制其抑菌活性的產(chǎn)生。
　　對PfaP蛋白的基因序列進(jìn)行克隆，并分別與表達(dá)載體pET24a(+)、pET26b(+)、pET32a(+)、pBAD/Myc-HisB及pRSFDuet-1連接，構(gòu)

6、建了重組表達(dá)菌株Escherichia coli BL21/pET24a(+)/PfaP、E. coli BL21/pET26b(+)/PfaP、E. coli BL21/pET32a(+)/PfaP、E. coli BL21/pBAD/Myc-HisB/PfaP以及 E. coli BL21/pRSFDuet-1/PfaP，并在體外誘導(dǎo)表達(dá)。PfaP蛋白能夠在大腸桿菌中得到異源表達(dá)，但可能由于在大腸桿菌中無法對該蛋白進(jìn)行正確的翻譯后修

7、飾，其異源表達(dá)產(chǎn)物不能夠形成有活性的成熟蛋白。
　　菌株 JG1的乙酸乙酯萃取物經(jīng)多步硅膠柱層析及半制備反相高效液相色譜分析，共分離得到5種具有抑菌活性的單體小分子化合物，分別為對羥基苯甲酸（1）、反式桂皮酸（2）、6-溴吲哚-3-乙酸（3）、N-羥基苯并異惡唑酮（4）和2'-脫氧腺苷（5）。其中，僅帶有一個(gè)溴原子的化合物3為黃褐色，稀釋后呈鮮艷黃色，推測其為菌株 JG1形成的一種色素分子，使菌落呈現(xiàn)金黃色。這5種小分子化合物對鰻

8、弧菌均具有抑菌活性，微量稀釋法檢測最小抑菌濃度分別為1.25、1.25、0.25、0.25和5 mg/ml。化合物3的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌范圍也最廣，對革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有抑菌活性。由此可見，色素分子與抑菌蛋白的協(xié)同作用使菌株 JG1表現(xiàn)出良好的抑菌活性。這5種小分子化合物均首次發(fā)現(xiàn)能對海水養(yǎng)殖病原菌產(chǎn)生抑制活性。
　　采用Illumina高通量測序技術(shù)對JG1的全基因組進(jìn)行了測序及分析，共預(yù)測得到4913個(gè)基因，總長度為4,

9、828,917bp，占基因組的87.71%。同時(shí)，在JG1基因組中發(fā)現(xiàn)預(yù)測的104個(gè)tRNA編碼基因和4個(gè)rRNA操縱子。與已知基因組序列的被囊假交替單胞菌（P. tunicata）D2、游海假交替單胞菌（P.haloplanktis） TAC125、大西洋假交替單胞菌（P. atlantica）T6c、2株假交替單胞菌TW-7和SM9913的COG注釋基因分布比較顯示，菌株JG1中參與次級代謝產(chǎn)物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝

10、以及翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與起源的相關(guān)基因的豐度均為最高，與其能合成豐富的代謝產(chǎn)物的特征相一致。JG1中參與防御機(jī)制的基因豐度也較高，表明其具有良好的環(huán)境適應(yīng)能力。
　　通過對JG1基因組的分析，發(fā)現(xiàn)了參與合成5種抑菌小分子化合物的相關(guān)基因，并預(yù)測了這些小分子化合物在JG1中的代謝途徑，而抑菌蛋白PfaP也參與了抑菌小分子物質(zhì)6-溴吲哚-3-乙酸的生物合成過程，進(jìn)一步表明JG1中的各種抑菌機(jī)制是緊密聯(lián)系的。在JG1的基因組中還發(fā)現(xiàn)有大量