野油菜黃單胞菌xanA基因的克隆與表達(dá).pdf

1、當(dāng)前，各種新類型的微生物多糖不斷出現(xiàn)，但黃原膠卻是世界范圍內(nèi)唯一在多種行業(yè)中得到廣泛應(yīng)用的具有重大商業(yè)價(jià)值的微生物多糖。它是以玉米淀粉為主要原料而產(chǎn)生的一種高分子量的雜聚糖。因其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)，因而具有獨(dú)特的流變性、良好的水溶性、對(duì)熱酸堿的穩(wěn)定性等許多優(yōu)異的物理化學(xué)性能，已被廣泛應(yīng)用于食品、飲料、化妝品、洗滌劑、陶瓷、石油開采、化工涂料、森林滅火等三十多種行業(yè)。采用基因技術(shù)改造植物、微生物，在當(dāng)前的時(shí)代已不是高不可測(cè)的尖端技術(shù)。隨著基因

2、技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)黃原膠產(chǎn)率的研究也由菌種選育、培養(yǎng)基、發(fā)酵條件等轉(zhuǎn)向基礎(chǔ)代謝流、基因工程和酶工程方面的研究。 本文主要研究了以下幾方面內(nèi)容： 1.對(duì)野油菜黃單胞菌的主要生物學(xué)特性和黃原膠的生物合成途徑，以及黃單胞菌分子生物學(xué)方面基礎(chǔ)知識(shí)進(jìn)行了研究。通過研究選擇了表達(dá)在合成途徑中具有重要作用的磷酸葡萄糖變位酶基因--產(chǎn)膠基因xanA，作為克隆的目標(biāo)；隨后利用Genebank對(duì)產(chǎn)膠基因xanA進(jìn)行了序列分析，并對(duì)該段基因表達(dá)

3、的磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶的性能和氨基酸序列進(jìn)行了研究。 2.采用比較普遍的CaCl<,2>法進(jìn)行大腸桿菌感受態(tài)的制備。比較了使用0.1mol/l CaCl<,2>試劑和0.1mol/l的CaCl<,2>：MgCl<,2>=4:1的溶液兩種不同方法制備的大腸桿菌DH5α和JM109感受態(tài)細(xì)胞的效果，發(fā)現(xiàn)使用后者能有效地提高感受態(tài)細(xì)胞的吸收能力，使重組細(xì)胞的構(gòu)建成功率更高。 3.通過斯坦福大學(xué)的在線引物設(shè)計(jì)程序，以GeneBank

4、中公布的野油菜黃單胞菌xanA基因序列(AF204145.1)為模版，設(shè)計(jì)出了六對(duì)引物，從中選擇了一對(duì)最優(yōu)的引物，通過梯度PCR比較了三種不同溫度對(duì)產(chǎn)膠基因xanA克隆效果的影響；得出的結(jié)論為，PCR的最適溫度為56℃。 4. 利用pUCm-T載體的特性，將回收的目的條帶與pUCm-T載體直接進(jìn)行連接。在連接過程中比較了兩種連接方法對(duì)重組克隆質(zhì)粒形成的影響，得出了16℃連接過夜的最優(yōu)連接條件，得到了含有產(chǎn)膠基因.xanA的重組克

5、隆質(zhì)粒pUCm-T-xanA。 5.通過轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109成功構(gòu)建了含有產(chǎn)膠基因.xanA的克隆質(zhì)粒pUCm-T-xanA大腸桿菌細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和假陽性篩選，最終成功獲得了重組細(xì)胞JM109-T-xanA。對(duì)得到的重組細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序和序列分析，結(jié)果證明了克隆結(jié)果的正確性。 6.利用表達(dá)質(zhì)粒pET28b，通過對(duì)重組克隆質(zhì)粒的抽提、酶切，構(gòu)建了含有產(chǎn)膠基因xanA的表達(dá)質(zhì)粒pET28b-xanA，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21

6、，通過氨芐青霉毒抗性篩選和菌落PCR篩選得到了陽性克隆細(xì)胞BL21-28b-xanA，隨后對(duì)重組細(xì)胞并進(jìn)行了測(cè)序和序列分析，結(jié)果表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。 7.利用pET28b和BL21的表達(dá)系統(tǒng)，使用一定濃度的IPTG試劑誘導(dǎo)重組細(xì)胞BL21-28b-xanA，表達(dá)出了磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶(PGM)。通過SDS-DAGE鑒定了表達(dá)產(chǎn)物的分子量，又進(jìn)一步通過紫外分光光度計(jì)法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了酶活的測(cè)定。結(jié)果表明磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶有表達(dá)，但是