維氏氣單胞菌SmpB蛋白對雙組份系統(tǒng)毒力傳感蛋白BvgS啟動子調(diào)控的研究.pdf

1、研究表明SmpB蛋白參與細(xì)胞眾多生理過程的調(diào)節(jié)，如機(jī)體新陳代謝、脂多糖生物合成、脂肪酸代謝途徑、致病菌入侵宿主等，其參與的調(diào)控作用對于細(xì)菌蛋白質(zhì)合成質(zhì)量控制、致病菌中毒力系統(tǒng)調(diào)控、維持機(jī)體正常生長及發(fā)育等過程具有關(guān)鍵作用。
　　本論文以致病菌維氏氣單胞菌作為實驗?zāi)Ｊ骄瑢ζ銼mpB蛋白調(diào)節(jié)雙組份系統(tǒng)毒力傳感蛋白BvgS啟動子現(xiàn)象與機(jī)制進(jìn)行探索，取得了以下結(jié)果：
　　1、使用增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)作為報告基因，與Bvg

2、S啟動子融合構(gòu)建載體 pDH114，同時構(gòu)建表達(dá)維氏氣單胞菌 SmpB的質(zhì)粒，將其共轉(zhuǎn)化到△tmRNA△SmpB E.coli Feldon中，通過測定Flu/OD600值的強(qiáng)弱來表征BvgS表達(dá)量的變化。結(jié)果表明維氏氣單胞菌SmpB蛋白對BvgS啟動子具有正調(diào)控作用。
　　2、進(jìn)一步利用維氏氣單胞菌SmpB蛋白截短突變體△N34和△C30以及定點(diǎn)突變體G11S12→A11A12，T14I15→A14A15，F(xiàn)26I27→A26A

3、27，E32A33G34→A32A33A34， G133K134→A133A134，D138K139R140→A138A139A140，K152→P152，探究影響其功能的關(guān)鍵區(qū)域與關(guān)鍵位點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)N端區(qū)域?qū)τ赟mpB發(fā)揮功能很關(guān)鍵，C端區(qū)域可以影響SmpB功能；G11S12及E32A33G34位點(diǎn)對于SmpB發(fā)揮功能比較重要。
　　3、通過構(gòu)建 pET-28a(+)-SmpB-His6表達(dá)載體、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、Ni-瓊脂糖凝

4、膠6FF純化、Western Blot檢測，獲得純化的SmpB蛋白，與BvgS啟動子進(jìn)行瓊脂糖凝膠遷移實驗。結(jié)果顯示SmpB/BvgS啟動子存在滯后現(xiàn)象，表明SmpB蛋白與BvgS啟動子可以特異性的相互作用。
　　4、通過基因敲除獲得維氏氣單胞菌△SmpB和△tmRNA突變株，利用實時定量 PCR技術(shù)分別對E.coli Feldon模式菌中BvgS啟動子下 eGFP轉(zhuǎn)錄本及△SmpB和△tmRNA突變株中BvgS基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測