LytSR雙組份信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控芽胞形成的機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)菌的雙組份信號(hào)系統(tǒng)能夠感受外界環(huán)境變化，通過(guò)磷酸化信號(hào)的傳遞，調(diào)節(jié)體內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)刺激作出應(yīng)答以適應(yīng)環(huán)境、得以生存。已明確枯草芽胞桿菌5個(gè)組氨酸激酶和主控應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子Spo0A起始芽胞形成，但是是否還有雙組份信號(hào)系統(tǒng)參與了芽胞形成的細(xì)胞過(guò)程仍然不清楚。在自然界分布廣泛的蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus，Bc)和蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）兩者同屬于芽胞桿菌屬，蠟樣芽胞桿菌族

2、。蠟樣芽胞桿菌能夠產(chǎn)生嘔吐毒素和腹瀉毒素引起人類或動(dòng)物的食物中毒，屬于條件性致病菌，其芽胞的強(qiáng)抗逆性是食品污染的主要來(lái)源;蘇云金芽胞桿菌能夠在芽胞形成的同時(shí)產(chǎn)生特異性致死效應(yīng)的殺蟲(chóng)蛋白晶體(Insecticidal Crystal Proteins，ICPs)，且安全、高效和對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)成為世界上應(yīng)用最為廣泛的殺蟲(chóng)微生物。因此研究蠟樣芽胞桿菌族的芽胞形成過(guò)程具有重要意義。
　　LytS-LytR是一個(gè)典型的雙組份信號(hào)系統(tǒng)，最先

3、在金黃色葡萄球菌發(fā)現(xiàn)，LytS作為膜結(jié)合蛋白接受外界刺激，信號(hào)傳遞給LytR，從而激活下游基因lrgAB的轉(zhuǎn)錄。LrgAB能夠抑制胞質(zhì)水解酶的活性，在細(xì)胞死亡和裂解過(guò)程中起著很重要的作用。在Bt和Bc中同樣具有l(wèi)ytSR-lrgAB的基因組織結(jié)構(gòu)，并且在所有測(cè)序的Bc和Bt菌株中非常保守，序列同源性高達(dá)90％以上，因而其功能具有相似性。本研究主要開(kāi)展了Bt中的LytSR在芽胞形成過(guò)程中的功能研究。
　　本實(shí)驗(yàn)采用同源重組的方法構(gòu)建

4、了lytSR基因的突變體HD△lytSR和lrgAB基因的突變體HD△lrgAB，對(duì)這兩個(gè)突變體的相關(guān)表型進(jìn)行了分析。在LB培養(yǎng)基中同時(shí)培養(yǎng)測(cè)定其生長(zhǎng)曲線，結(jié)果表明HD△lytSR較野生型HD73相比，其生長(zhǎng)無(wú)明顯差別，芽胞形成率的測(cè)定表明HD△lytSR較野生型相比有明顯降低，細(xì)胞自溶性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lytSR基因缺失改變了菌體的自溶性，但HD△lrgAB與野生型相比沒(méi)有明顯變化。構(gòu)建啟動(dòng)子PlrgAB與lacZ基因的融合載體，并將上述載體

5、轉(zhuǎn)入HD73菌株、lytSR突變體中，通過(guò)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性發(fā)現(xiàn)lrgAB的轉(zhuǎn)錄受LytSR的正調(diào)控。
　　構(gòu)建啟動(dòng)子PlytSR與lacZ基因的融合載體，并將上述載體轉(zhuǎn)入HD73菌株、sigE突變體中，通過(guò)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性發(fā)現(xiàn)lytSR的轉(zhuǎn)錄受SigE控制。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)lytSR基因的缺失影響了芽胞的內(nèi)吞過(guò)程。在枯草芽胞桿菌中，已有研究表明spoⅡD、spoⅡM和spoⅡP受SigE的控制，并且spoⅡD、

6、spoⅡM、spoⅡP的缺失以及sigE基因的單獨(dú)缺失都會(huì)導(dǎo)致菌體在芽胞形成過(guò)程中雙隔膜的出現(xiàn)。在蘇云金芽胞桿菌中，lytSR基因的缺失也會(huì)出現(xiàn)雙隔膜，為了探究spoⅡD、spoⅡM、spoⅡP與lytSR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系，本研究中構(gòu)建了上述三個(gè)基因的啟動(dòng)子和lacZ基因的融合載體，將融合載體轉(zhuǎn)入HD73菌株、lytSR突變體中，通過(guò)測(cè)定β-半乳糖苷酶活性發(fā)現(xiàn)spoⅡP的轉(zhuǎn)錄受LytSR調(diào)控。
　　此前，沒(méi)有報(bào)道說(shuō)明雙組份信號(hào)系統(tǒng)參