雙組份系統(tǒng)AfsQ1-Q2對天藍(lán)鏈霉菌中coelimycin P2合成的調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、鏈霉菌具有豐富的代謝調(diào)控機(jī)制，由于鏈霉菌在抗生素合成中的重要地位，研究鏈霉菌的次級代謝特別是抗生素合成的調(diào)控機(jī)制具有重要的研究意義。本文主要研究天藍(lán)鏈霉菌中的雙組份調(diào)控系統(tǒng)AfsQ1/Q2對抗生素coelimycin P2（也被稱為yCPK）合成的調(diào)控機(jī)制。
　　之前的研究表明，在以75mM的谷氨酸鈉（Glu）為唯一氮源的基本培養(yǎng)基（MM）上，天藍(lán)色鏈霉菌中的雙組份調(diào)控系統(tǒng)（TCS）AfsQ1/Q2可以激活黃色的抗生素coelim

2、ycin P2（也被稱為yCPK）的產(chǎn)生，并且應(yīng)答調(diào)控蛋白AfsQ1能夠結(jié)合到coelimycin P2的兩個(gè)生物合成基因cpkA和cpkD的基因間隙。本文對此進(jìn)行了更加深入的研究。為了排除放線紫紅素（ACT）、十一靈菌紅素(RED)（分別呈現(xiàn)藍(lán)色和紅色）對我們?nèi)庋塾^察coelimycin P2產(chǎn)量變化的干擾，本研究以野生型天藍(lán)鏈霉菌（Streptomyces coelicolor）M145為出發(fā)菌株，敲除了ACT和RED生物合成基因簇

3、中的途徑特異性調(diào)控基因actII-ORF4、redD，獲得菌株SBJ512，該菌株喪失ACT和RED的合成能力。我們首先探究了在基本培養(yǎng)基（MM）上，不同濃度的谷氨酸鈉對coelimycin P2合成的影響，發(fā)現(xiàn)在谷氨酸鈉濃度為75mM的條件下， SBJ512的coelimycin P2的合成量最多。在含有75mM的谷氨酸鈉為唯一氮源的MM培養(yǎng)基上，探究了雙組份系統(tǒng)基因afsQ1/Q2缺失對coelimycin P2合成的影響。結(jié)果表明

4、，當(dāng)缺失afsQ1/Q2之后，突變菌株SBJ513停止合成coelimycin P2，并且我們對coelimycin P2合成基因簇進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)afsQ1/Q2缺失導(dǎo)致整個(gè)coelimycin P2生物合成基因簇轉(zhuǎn)錄的顯著下調(diào)，其中cpkA/B/C轉(zhuǎn)錄下調(diào)的最厲害，下調(diào)了約20倍，凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)（EMSA）表明， AfsQ1僅僅能夠結(jié)合到coelimycin P2合成基因簇中聚酮合酶基因cpkA/cpkD之間的間隙區(qū)，而不能結(jié)合到

5、基因簇內(nèi)其他可能的啟動子區(qū)域。根據(jù)之前蛋白AfsQ1結(jié)合基序的保守性，在cpkA/cpkD之間找到了AfsQ1的結(jié)合序列，并對其進(jìn)行原位堿基突變，構(gòu)建了突變體SBJ514。對該菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)，cpkA/D基因間隔區(qū)內(nèi)AfsQ1結(jié)合位點(diǎn)的突變僅引起 cpkA/B/C（編碼三個(gè)大的Ⅰ類聚酮合酶）的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，而其他基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有明顯的變化或有明顯上調(diào)。這些結(jié)果表明，AfsQ1/Q2可能通過結(jié)合于cpkA和cpkD的基因間隙區(qū)，影響3