天藍(lán)色鏈霉菌A3（2）中bldH基因的克隆與研究.pdf

1、該研究嘗試用不同的方法對(duì)bldH基因進(jìn)行克隆.首先試圖通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)對(duì)bldH基因進(jìn)行克隆.對(duì)攜帶有轉(zhuǎn)座子Tn4560的溫敏型復(fù)制性質(zhì)粒pUC1169進(jìn)行了一系列的改造,構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pHZ2508,作為新轉(zhuǎn)座子的載體.該質(zhì)粒在M145中具有較高的轉(zhuǎn)座頻率,并且可以通過對(duì)轉(zhuǎn)移接合子的直接篩選得到轉(zhuǎn)座突變株.由于發(fā)現(xiàn)pSPH2可以反式互補(bǔ)bldH突變株WC109,所以沒有繼續(xù)用pHZ2508進(jìn)行WC109中bldH的克隆.pSPH2

2、的外源片段包含有3個(gè)完整的開放讀碼框（ORF）.將覆蓋該區(qū)域的科斯質(zhì)粒2SCC13導(dǎo)入WC109,可以部分互補(bǔ)其光禿表型.對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行松弛培養(yǎng),篩選同質(zhì)化（homogenolized）后代,即丟失2SCC13載體抗生的Km<'s>后代,發(fā)現(xiàn)同質(zhì)化后代產(chǎn)孢表型發(fā)生分離,暗示W(wǎng)C109菌株的染色體在該區(qū)域發(fā)生了突變.為了進(jìn)一步定位該突變基因,構(gòu)建了一系列的亞克隆,并將它們導(dǎo)入WC109.觀察產(chǎn)孢表型,將具有使WC109部分恢復(fù)產(chǎn)孢功能的區(qū)域

3、濃縮定位adpA<,sc>基因.通過PCR擴(kuò)增分別克隆得到WC109和WC181兩種bldH突變株的adpA<,sc>基因,并分別進(jìn)行測序.將adpA<,sc>基因中的TTA密碼子定點(diǎn)誘變成為其簡并密碼子TTG,得到定點(diǎn)誘變基因adpA<,sc><'*>分別引入到整合型載體pSET152和低拷貝載體pHJL401上,然后導(dǎo)入bldA突變株J1700中,發(fā)現(xiàn)adpA<,sc><'*>基因只有至少存在1～10個(gè)拷貝時(shí)才可以明顯地使J1700