天藍(lán)色鏈霉菌中IV型限制酶ScoMcrA的功能研究.pdf

1、由 A、T、C、G四種堿基以及表觀修飾堿基5-甲基胞嘧啶等組成的DNA是生命體的遺傳物質(zhì)，以往一般認(rèn)為由 C、H、O、N、P五種元素組成。本研究室在天然 DNA中發(fā)現(xiàn)了第六種元素S，它以由 dnd基因簇編碼的磷硫?；揎椀男问酱嬖凇?br>　　DNA的修飾和限制是一對孿生兄弟，在細(xì)菌和噬菌體的軍備競賽中，細(xì)菌發(fā)展出 DNA甲基化、羥甲基化等修飾依賴型的限制系統(tǒng)即 IV型限制酶，可以對修飾的DNA進(jìn)行切割以保護(hù)細(xì)菌自身遺傳穩(wěn)定性。

2、　　本研究從 dnd基因簇在天藍(lán)色鏈霉菌中的異常表達(dá)現(xiàn)象出發(fā)，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中含有一種磷硫酰化修飾依賴型的IV型限制酶，并且定位了其編碼基因?yàn)?scoMcrA，實(shí)驗(yàn)證實(shí)了它位于一個可移動的基因組島上。
　　在體外表達(dá) ScoMcrA的過程中，我們發(fā)現(xiàn)帶有 scoMcrA的表達(dá)載體不能導(dǎo)入帶有 Dcm基因型（DNA胞嘧啶甲基化，位點(diǎn)為C5mCA/TGG）的大腸桿菌，說明 ScoMcrA也是一種 Dcm甲基化依賴型限制酶。純化的Sco

3、McrA在錳離子的存在下可以特異性的識別磷硫?；揎椀腄NA并在離修飾位點(diǎn)兩側(cè)17～25個堿基的位置切割磷酸二酯鍵；同時，還可以特異性的識別 Dcm甲基化修飾的DNA并在修飾位點(diǎn)兩側(cè)12～16個堿基的位置進(jìn)行切割。此外，我們還通過 Footprinting實(shí)驗(yàn)確定了 ScoMcrA對甲基化修飾 DNA的結(jié)合位點(diǎn)。
　　結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究解析了 ScoMcrA單體及其與磷硫酰化修飾DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，揭示了 ScoMcrA通過將磷硫酰