天藍(lán)色鏈霉菌強(qiáng)啟動(dòng)子的構(gòu)建與應(yīng)用研究.pdf

1、鏈霉菌因具有強(qiáng)大的次級(jí)代謝能力而著稱，大量研究表明鏈霉菌群體感應(yīng)在調(diào)控次級(jí)代謝生物合成和形態(tài)分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)室前期工作以鏈霉菌γ-丁酸內(nèi)酯群體感應(yīng)系統(tǒng)為研究對(duì)象，闡述了該調(diào)控系統(tǒng)在調(diào)控次級(jí)代謝及分化發(fā)育中的作用及其調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)在天藍(lán)色鏈霉菌中γ-丁酸內(nèi)酯受體 ScbR和假γ-丁酸內(nèi)酯受體ScbR2都能夠結(jié)合kasO啟動(dòng)子，且Sigma因子HrdB可以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性。為了在鏈霉菌中得到一個(gè)廣譜的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，我們首先在大腸

2、桿菌中進(jìn)行分析，證實(shí)在大腸桿菌中kasO啟動(dòng)子表現(xiàn)為組成型啟動(dòng)子。
　　本文以提高該啟動(dòng)子活性為目的，首先去除其OB結(jié)合位點(diǎn)并截短其長(zhǎng)度，得到活性最強(qiáng)的kasOp3，然后通過(guò)隨機(jī)突變OA位點(diǎn)構(gòu)建啟動(dòng)子庫(kù)，篩選驗(yàn)證得到活性最強(qiáng)的kasOp*。本工作還分別用 xylE和卡那報(bào)告基因在天藍(lán)色鏈霉菌，阿維鏈霉菌和委內(nèi)瑞拉鏈霉菌比較了kasOp*、SF14p和ermEp*三個(gè)啟動(dòng)子的活性，結(jié)果顯示kasOp*活性最高，轉(zhuǎn)錄時(shí)序和過(guò)表達(dá)act

3、II-ORF4均證實(shí)ksaOp*是一個(gè)更理想的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子。提供了一個(gè)啟動(dòng)子活性評(píng)價(jià)方法，為后續(xù)的啟動(dòng)子探測(cè)提供了思路。多殺菌素是對(duì)農(nóng)業(yè)蟲害防治及糧食倉(cāng)儲(chǔ)安全均具有重大意義的農(nóng)用抗生素，但是其生理周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低等條件制約了其的推廣及應(yīng)用。為了深入揭示刺糖多孢菌合成多殺菌素的調(diào)控特點(diǎn)以便更好的應(yīng)用于產(chǎn)量提高，對(duì)相關(guān)方向進(jìn)行了探討。首先采用上述建立的xylE，neo報(bào)告基因啟動(dòng)子探測(cè)技術(shù)，探測(cè)了位于多殺菌素生物合成基因簇內(nèi)的9個(gè)啟動(dòng)子活性

4、，并進(jìn)一步通過(guò)熒光定量PCR（qPCR），分析了這9個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序，還分析了不在基因簇內(nèi)但對(duì)多殺菌素糖基合成修飾所必需的負(fù)責(zé)糖基前體供應(yīng)和鼠李糖合成的4個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序，結(jié)果表明多殺菌素生物合成基因簇內(nèi)的9個(gè)基因在菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)有較高的轉(zhuǎn)錄，這和發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵液中此時(shí)開始大量積累多殺菌素一致；本論文工作還發(fā)現(xiàn)，位于簇外的4個(gè)與糖基供應(yīng)相關(guān)的基因和基因簇內(nèi)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)序不同，它們?cè)诰w生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期有較高的轉(zhuǎn)錄活性，這暗示多殺菌素聚酮