一種新的CD13小分子抑制劑抗肝癌的作用及其機制研究.pdf

1、研究目的：
　　肝癌是全球發(fā)病率第五、死亡率第二的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命。當(dāng)前，肝癌在全球的發(fā)病率呈上升趨勢，中國新增肝癌病例和死亡人數(shù)均居世界首位，約占全球總數(shù)的50％左右。由于肝癌的預(yù)后不佳，因此，需要尋求新的治療手段或藥物。
　　CD13，又稱氨肽酶N(APN)，是一種Zn2+依賴的位于細胞表面的金屬蛋白酶，能夠與從寡肽N末端切除氨基酸的糖蛋白結(jié)合。CD13在多種組織細胞均有表達，例如神經(jīng)細胞、髓樣細胞、內(nèi)皮細

2、胞以及成纖維細胞等。同時，CD13在急性髓性白血病和多種實體瘤組織中呈現(xiàn)高表達的現(xiàn)象。因此，該分子又被稱作腫瘤標(biāo)記分子。由于CD13分布范圍廣，且生物學(xué)功能多樣，不僅參與多種生理病理過程，還可作為肝癌干細胞的標(biāo)志分子。由于CD13分布廣泛，在臨床治療中需要選擇特異性強的靶向抑制劑進行治療，這是研發(fā)新型CD13抑制劑所面臨的最大挑戰(zhàn)。
　　由此，本研究利用分子生物學(xué)手段，通過體內(nèi)外實驗，對我院藥物化學(xué)課題組合成的新的CD13小分子抑

3、制劑4.1-3k在治療肝癌中的作用進行了研究，并對其作用機制進行了探討，為臨床治療肝癌以及研發(fā)靶向藥物提供了參考。
　　研究方法：
　　1.以肝癌細胞系為模型，采用流式細胞術(shù)檢測CD13分子在不同細胞系表面的表達情況;
　　2.采用MTT法檢測CD13抑制劑對HepG2、PLC/PRF/5以及HepG2.2.15細胞增殖能力的影響;PI單染、Annexin V/PI雙染法分別檢測CD13抑制劑對HepG2、PLC/PR

4、F/5以及HepG2.2.15細胞周期和細胞凋亡的影響;熒光定量PCR及Western Blot實驗檢測細胞凋亡基因Bcl-2、Bax的表達變化;
　　3.Transwell實驗分析CD13抑制劑對HepG2、HepG2.2.15細胞遷移的影響;熒光定量PCR檢測經(jīng)CD13抑制劑處理的HepG2、HepG2.2.15細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9的表達;
　　4.血管生成實驗檢測CD13抑制處理HepG2、PLC/P

5、RF/5以及HepG2.2.15細胞后的血管生成情況;熒光定量PCR檢測經(jīng)CD13抑制劑處理的HepG2和HepG2.2.15細胞中與血管生成相關(guān)的VEGF、MCP-1等基因的表達;
　　5.Western blot實驗檢測CD13抑制劑對HepG2、HepG2.2.15細胞MAPK、NF-κB以及STAT3信號通路基因表達;熒光定量PCR檢測經(jīng)CD13抑制劑處理的HepG2以及HepG2.2.15細胞中炎癥因子IL-6、IL-1

6、0等基因的表達;
　　6.流式細胞術(shù)檢測DEN/CCL4誘導(dǎo)肝纖維化模型、HBV模型、肝癌細胞荷瘤模型小鼠各個器官中CD13的表達，統(tǒng)計經(jīng)CD13抑制劑治療后的荷瘤裸鼠的生存期;
　　7.建立肝癌的肺轉(zhuǎn)移模型，經(jīng)CD13抑制劑治療后觀測肺組織的轉(zhuǎn)移情況。
　　研究結(jié)果：
　　1.CD13在不同肝癌細胞中表達情況不同，其中含S抗原或HBV基因組的肝癌細胞系中CD13表達較高。
　　2.CD13抑制劑顯著抑制肝

7、癌細胞的增殖能力，對HepG2.2.15細胞的作用最為明顯;在高表達CD13的肝癌細胞系中，4.1-3k的抑制效果強于對照藥Bestatin。CD13抑制劑處理后，肝癌細胞凋亡比例增加，4.1-3k在高表達CD13的肝癌細胞系中促凋亡效果強于Bestatin，但對細胞周期無影響。
　　3.CD13抑制劑能夠抑制HepG2、HepG2.2.15細胞遷移，且作用效果強于Bestatin。同時，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2、MMP9在經(jīng)CD1

8、3抑制劑處理后的細胞中表達下調(diào)。
　　4.CD13抑制劑處理肝癌細胞后，新生血管的生成明顯受到抑制。在CD13高表達的肝癌細胞系中，4.1-3k抑制血管生成作用明顯優(yōu)于Bestatin。同時，血管生成相關(guān)基因VEGF、MCP-1在CD13抑制劑處理后顯著下調(diào)。
　　5.經(jīng)CD13抑制劑處理后，HepG2、HepG2.2.15細胞中MAPK、NF-κB以及STAT3信號通路相關(guān)基因的活化受到抑制;同時，細胞中炎癥因子IL-6、

9、IL-8表達顯著下調(diào)。a
　　6.DEN/CCL4誘導(dǎo)的肝臟纖維化模型小鼠及HBV模型小鼠中，CD13在免疫負調(diào)細胞中表達較高。經(jīng)CD13抑制劑治療后，HCC荷瘤小鼠中腫瘤的生長受到抑制，生存期延長。
　　7.在BALB/c肺轉(zhuǎn)移模型小鼠中，經(jīng)CD13抑制劑治療后肺結(jié)節(jié)數(shù)目明顯減少，且在4.1-3k組效果最為顯著。
　　結(jié)論及意義：
　　本文對新型的CD13小分子抑制劑4.1-3k的抗肝癌作用進行系統(tǒng)評價，發(fā)現(xiàn)4