p18小分子抑制劑體外擴增人造血干細(xì)胞的作用研究.pdf

1、目的:造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)是最早在臨床治療中進(jìn)行常規(guī)應(yīng)用的的干細(xì)胞類型，其具有自我更新及多向分化潛能。盡管HSCs移植已成熟地應(yīng)用于治療各種類型血液系統(tǒng)惡性疾病，但由于傳統(tǒng)移植方法中，來源于骨髓或動員后外周血中的HSCs進(jìn)行移植時需要供體與受體人白細(xì)胞抗原(Human leukocyteantigen，HLA)配型全相合，因而導(dǎo)致其在臨床應(yīng)用中仍受到了較大限制。臍帶血作為一種新的HSC

2、s來源具有多種臨床應(yīng)用優(yōu)勢，包括其可允許HLA部分錯配，同時移植后移植物抗宿主病(GVHD)的發(fā)生率大大降低。但由于單份臍帶血中HSCs含量較低因而目前僅可滿足兒童患者及體重較低的成人患者需要。進(jìn)入細(xì)胞周期是HSCs進(jìn)行自我更新及擴增的最后一步，而G1期的調(diào)控可能是自我更新過程的關(guān)鍵一步。因此，為滿足臨床治療需求以及研究HSCs擴增和自我更新的調(diào)控機制，我們選擇細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵蛋白p18作為靶點，設(shè)計篩選出一系列潛在的可使HSCs體外擴

3、增小分子化合物，并進(jìn)一步對其內(nèi)在機制進(jìn)行研究。
　　方法:首先，我們采用慢病毒感染方式敲降人臍帶血HSCs中p18的表達(dá)，并對敲降后的細(xì)胞分別進(jìn)行干細(xì)胞表型分析以及體外造血功能檢測。隨后，我們以p18作為靶點，根據(jù)前期計算機虛擬篩選的結(jié)果獲得一系列小分子化合物，并利用小鼠HSCs單細(xì)胞集落形成實驗對這些化合物的造血擴增作用進(jìn)行了初步分析篩選。當(dāng)確認(rèn)該類小分子化合物的造血擴增作用后，我們又用這些小分子化合物處理人臍帶血HSCs，進(jìn)而

4、篩選出一個效果最優(yōu)的化合物005A。通過HSCs體外培養(yǎng)濃度梯度實驗我們確定了化合物005A的最佳作用濃度。我們對化合物005A處理后的細(xì)胞進(jìn)行了HSCs表型分析，隨后又對化合物005A處理后的細(xì)胞進(jìn)行了體外短期、長期造血功能實驗以及體內(nèi)免疫缺陷鼠移植實驗，以進(jìn)一步驗證化合物005A的造血擴增作用。我們還利用SPR實驗以及CDK6酶活性實驗檢測化合物005A對p18蛋白的抑制作用。此外我們利用單細(xì)胞PCR技術(shù)對化合物005A引起的細(xì)胞內(nèi)

5、基因變化進(jìn)行了分析，據(jù)此對可能的調(diào)控機制進(jìn)行研究。
　　結(jié)果:通過敲降人臍帶血HSCs內(nèi)的p18表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞術(shù)檢測所得HSCs比例明顯增加，同時體外短期造血集落數(shù)量也明顯升高，體外長期培養(yǎng)中的鵝卵石樣原始造血區(qū)域頻率也顯著增加。當(dāng)利用我們設(shè)計出的p18小分子抑制劑化合物對小鼠HSCs進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)，部分化合物可達(dá)到提高小鼠HSCs擴增的作用，其中化合物005A的ED50僅為5.2nM。隨后將該系列化合物應(yīng)用于人臍帶血HS

6、Cs也發(fā)現(xiàn)了類似的作用，且化合物005A仍為效果最優(yōu)化合物。為進(jìn)一步優(yōu)化化合物005A的造血擴增作用，我們采用了濃度梯度實驗，從而確定20nM為其擴增人HSCs的最適濃度，其處理后可顯著增加HSCs群體(CD34+ CD49f+)的比例?；衔?05A可達(dá)到體外短期造血集落以及體外長期培養(yǎng)中的鵝卵石樣原始造血區(qū)域頻率均顯著增加的作用。造血功能檢測的金標(biāo)準(zhǔn)——免疫缺陷鼠移植實驗結(jié)果表明，化合物005A處理后細(xì)胞造血能力與未培養(yǎng)前基本相同，

7、且其移植成功率明顯升高。對化合物005A與p18蛋白的相互作用實驗發(fā)現(xiàn)，005A可與p18蛋白結(jié)合，并可抑制其活性。單細(xì)胞PCR實驗結(jié)果顯示，化合物005A處理后Notch通路相關(guān)基因表達(dá)顯著增加。
　　結(jié)論:通過對p18的表達(dá)干擾實驗發(fā)現(xiàn)，p18蛋白在人臍帶血HSCs擴增調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。因此我們認(rèn)為p18是一個HSCs擴增的理想靶點。通過對p18小分子抑制劑體外造血擴增作用的研究發(fā)現(xiàn)，其可明顯提高HSCs的數(shù)量，同時又可維