miR-21小分子抑制劑的篩選及腫瘤靶向治療的實驗研究.pdf

1、近年來，微RNA(microRNAs，miRNAs)作為進化保守的一類非編碼RNAs在調(diào)控基因表達的功能上引起了人們的極大關(guān)注。MiRNAs的長度大約為19-25個核苷酸序列，它通過與靶點mRNA結(jié)合抑制其翻譯或啟動降解來發(fā)揮作用。目前在人類基因組織中已發(fā)現(xiàn)超過1000種miRNAs，它們的異常表達在包括惡性腫瘤在內(nèi)的人類多種疾病發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用，并且miRNA的測序分析結(jié)果揭示其表達特征可以作為某些惡性腫瘤的分子標簽，對指導惡

2、性腫瘤的分級，診斷，預后及治療具有重大意義。因而探索典型的差異表達的miRNAs，確定其與惡性腫瘤的相關(guān)性，尋求抑制其活性的高效靶向藥物，是極具潛力的腫瘤治療策略。
　　MiR-21是人類基因組中最早發(fā)現(xiàn)的與癌癥相關(guān)的微RNA，在腦膠質(zhì)母細胞瘤，乳腺癌，胃癌，結(jié)腸癌，肺癌等多種腫瘤中存在高表達，并通過作用于多個靶點參與了多條與腫瘤發(fā)生，進展，轉(zhuǎn)移，治療耐受相關(guān)的信號通路。目前針對miRNAs干擾應(yīng)用較多的是非小分子的核苷酸類制劑，

3、但由于投遞效率較低且藥效學及藥代學特性的缺陷限制了其臨床應(yīng)用，因而研發(fā)miR-21高效的天然小分子抑制劑將為腫瘤的靶向治療指明新的方向。
　　本課題第一部分我們通過利用3D結(jié)構(gòu)模擬計算機輔助藥物設(shè)計的方法構(gòu)建出了pre-miR-21莖環(huán)部位的3D結(jié)構(gòu)，并與美國癌癥研究所小分子數(shù)據(jù)庫中的化合物進行分子對接，從而獲得候選小分子化合物。接著對候選化合物進行體外miR-21抑制效果檢測，確定了具有潛力的miR-21小分子抑制劑AC1MMY

4、R2。AC1MMYR2對miR-21的抑制效果具有濃度依賴性及時間依賴性并可以上調(diào)miR-21功能性靶點PTEN，PDCD4及RECK的表達水平，并在作用6h時，對miR-21的抑制具有較好的特異性，而在作用24h時，miR-200a/b，miR-218，miR-1280等miRNAs表達出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)。此外，與miR-21低表達的腫瘤細胞相比，AC1MMYR2對miR-21高表達狀態(tài)的腫瘤細胞具有更強的抑制效果。
　　在本

5、課題第二部分中我們發(fā)現(xiàn)AC1MMYR2在抑制mature miR-21表達水平的同時，抑制了pri-miR-21的表達水平與STAT3的轉(zhuǎn)錄活性，而pre-miR-21的表達水平卻被上調(diào)。進一步的研究證明AC1MMYR2在pre-miR-21生成maturemiR-21的過程中發(fā)揮作用，它通過與Dicer競爭性結(jié)合pre-miR-21莖環(huán)結(jié)合位點，抑制了pre-miR-21剪切生成mature miR-21。而STAT3被報道可以與mi

6、R-21編碼基因的啟動子上游結(jié)合促進miR-21的轉(zhuǎn)錄。因而，我們推測存在AC1MMYR2-STAT3-pri-miR-21的反饋環(huán)路，這在一定程度上對AC1MMYR2下調(diào)pri-miR-21的機制作出了解釋。同時，AC1MMYR2對于Dicer結(jié)合位點的作用具有特異性，將pre-miR-21莖環(huán)部位的Dicer結(jié)合位點進行點突變之后，突變體的3D結(jié)構(gòu)與AC1MMYR2結(jié)合力減弱，AC1MMYR2的活性降低。此外，AC1MMYR2發(fā)揮m

7、iR-21抑制作用依賴于Dicer的表達水平，當Dicer表達水平較低時，限制了AC1MMYR2對miR-21的抑制作用。
　　本課題第三部分我們重點探討了AC1MMYR2抑制miR-21表達水平后，對5種上皮性腫瘤細胞惡性生物學行為的影響。AC1MMYR2可降低腫瘤細胞的克隆形成率，并將細胞周期阻滯在G0/G1期從而抑制了腫瘤細胞的增殖能力;同時AC1MMYR2促進了腫瘤細胞的凋亡率及Caspase3/7活性并抑制了其侵襲和遷移

8、能力。此外，AC1MMYR2處理后的細胞上皮性標志物E-cadherin表達水平升高，而間質(zhì)性標志物N-cadherin，β-catenin，ZEB1，ZEB2，MMP9的表達水平降低，這表明AC1MMYR2在某種程度上可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。在AC1MMYR2處理6h后的U87細胞測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，534個差異表達基因顯著富集于癌癥相關(guān)通路及TGF-β通路（在14條具有統(tǒng)計學意義的信號通路中排前2位），這在一定程度上揭示了作為m

9、iR-21的小分子抑制劑AC1MMYR2作用效果與腫瘤及EMT過程密切相關(guān)。
　　本課題第四部分通過構(gòu)建U87膠質(zhì)瘤顱內(nèi)模型及MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌原位模型對AC1MMYR2的藥效在體內(nèi)做了進一步的驗證。AC1MMYR2顯著抑制了腫瘤生長速度，改善了顱內(nèi)荷瘤小鼠的生存預后，并抑制了乳腺癌腫瘤細胞向肺內(nèi)的轉(zhuǎn)移。同時，我們還在治療結(jié)束后對U87膠質(zhì)瘤顱內(nèi)模型的小鼠重要內(nèi)臟組織進行了H&E染色，AC1MMYR2治療組對肝

10、、腎等器官并未引起肉眼看見的形態(tài)變化。此外，我們對非特異性miR-21小分子抑制劑BASI(NSC-211332)的U87顱內(nèi)實驗表明，BASI可以抑制顱內(nèi)腫瘤的生長，并改善了小鼠的生存預后，而這一過程是通過改變一系列β-catenin相關(guān)的miRNAs(miR-21，miR-23b，miR-200a, miR-181d)間接抑制Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的。
　　綜上所述，在本研究中我們通過利用計算機輔助設(shè)計及高通量

11、篩選的方法確定了一種高效且特異性的miR-21小分子抑制劑-AC1MMYR2。它不僅可以通過上調(diào)miR-21功能性靶點PTEN、PDCD4及RECK的表達水平，而且還可以通過上調(diào)miR-200a/b和miR-181d的表達水平逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程來發(fā)揮顯著的抗腫瘤效果?？傊覀兊难芯勘砻鰽C1MMYR2是一種有效的且對正常臟器無毒性作用的小分子抑制劑，對于人類上皮性腫瘤具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
　　AC1MMYR2通過阻斷Dic