小分子脾酪氨酸激酶(Syk)抑制劑篩選的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 華東理工大學藥學院偶然發(fā)現(xiàn)了一個小分子化合物HL131012對Syk的激酶活性具有較強的抑制作用，針對HL131012結構，按照傳統(tǒng)藥物化學結構修飾手段進行了一系列結構優(yōu)化研究，合成了48個衍生物，為求證該化合物的生物學活性，與我們合作本課題的研究。
　　 目的:
　　 測試這些衍生物對Syk的抑制活性，通過與陽性藥物(R935788)進行對比，篩選出對滑膜細胞增殖抑制作用較好的小分子化合物，為

2、將來尋找到一種具有選擇性抑制Syk的藥物提供實驗依據。
　　 方法:
　　 1．小分子化合物對Syk抑制活性的檢測：在固定條件下利用Caliper mobility shiftassay對HL131012及其48個衍生物的Syk激酶抑制作用進行檢測，陰性對照為不加化合物(blank)組，陽性對照組采用陽性藥物Staurosporine（STS組）。每組設8個復孔。檢測項目是激酶Syk在ATP Km濃度下，共49個化合物梯

3、度稀釋的抑制百分率，稀釋成5個濃度點：50 uM，16.67 uM,5.56 uM，1.85 uM，0.62 uM，進行單孔檢測。結果采用半數有效抑制濃度(IC50)表示。
　　 2.AA FLS的鑒定：購入佐劑型大鼠類風濕性關節(jié)炎成纖維滑膜細胞，復蘇后穩(wěn)定傳代，取生長對數期的滑膜細胞，通過普通光鏡觀察滑膜細胞大體結構、透射電鏡觀察滑膜細胞超微結構，流式細胞儀技術檢測滑膜細胞血管粘附分子1(VCAM-1/CD106)、CD90、

4、CD34細胞表面分子表達情況對滑膜細胞型別進行鑒定。
　　 3．MTT法觀察不同的小分子化合物對AA FLS增殖的影響：取生長對數期滑膜細胞，對第一步中篩選出的數種小分子Syk抑制劑化合物根據是否給予TNF-α刺激和Syk抑制劑干預隨機分成5組。①調零組：20％胎牛血清高糖DMEM+MTT+DMSO;②對照組：FLS+50ng/mL TNF-α+MTT+DMSO；③高濃度組:50ng/mLTNF-α+10umol/L Syk抑制

5、劑+MTT+DMSO;④中濃度組：50ng/mL TNF-α+5 umol/L。Syk抑制劑+MTT+DMSO；⑤低濃度組：50ng/mL TNF-α+2.5 umol/L Syk抑制劑+MTT+DMSO。用紫外線分光光度計選用493nm波長測定吸光度(A)值來測定細胞增殖反應，每組設6個復孔。各組結果以均數±標準差(-χ±S）表示，組間資料方差齊時采用單因素方差分析和snk檢驗，用SPSS16.0軟件進行分析，檢驗標準P=0.001，

6、P＜0.001為相差顯著，有統(tǒng)計學意義，比較分析抑制細胞增殖效果較好的一個或數個小分子Syk抑制化合物。
　　 結果:
　　 1．采用Caliper mobility shift assay對小分子化合物Syk抑制活性的檢測：HL131012本身及其48個衍生物中，有7個化合物(HL131012、HL131023、HL131041、HL131046、HL131047、HL131049和HL131057)對Syk的半數有效

7、抑制濃度(IC50值)較為滿意，這7個化合物抑制Syk活性的半數有效抑制濃度依次為：0.53uM，1.6μM,0.9μM,0.52μM,2μM,2.4μM,0.39μM。
　　 2.細胞培養(yǎng)至第三代時，普通光鏡觀察AA大鼠成纖維滑膜細胞生長形態(tài)均一，胞體成長梭形并伸出突起，透射電鏡觀察細胞突起長而粗，細胞內粗面內質網豐富，缺乏高爾基復合體、小泡和囊泡；FCM檢測細胞VCAM-1(CD106)、CD90為陽性，CD34為陰性，符合

8、成纖維滑膜細胞典型形態(tài)學特征。
　　 3．不同的小分子化合物孵育AA FLS后，通過MTT比色法的分析吸光度A值，反應AA FLS的增殖情況，與陽性藥物(R935788)進行對比，結果發(fā)現(xiàn)對抑制細胞增殖影響的滿意程度的化合物遞減順序依次為HL131057，HL131049，HL131041，HL131046, HL131023, R935788。
　　 結論:
　　 1．HL131012本身及其48個衍生物中，其

9、中7個化合物(HL131012、HL131023、HL131041、HL131046、HL131047、HL131049和HL131057)表現(xiàn)出較強的Syk抑制效果；
　　 2．部分小分子Syk抑制劑化合物能抑制TNF-α刺激的滑膜細胞的增生，這些化合物抑制細胞增殖按作用效果遞減順序依次為HL131057，HL131049，HL131041,HL131046, HL131023, HL131046, HL131012;