JAK2激酶小分子抑制劑在胃癌治療中的作用及其分子機制.pdf

1、胃癌是全世界最常見的、致死率極高的惡性腫瘤之一。隨著醫(yī)學的不斷進步，胃癌的診斷和治療手段已經(jīng)取得了巨大的發(fā)展，但是，我國早期胃癌的檢出率很低，一般為10％左右。進展期胃癌的治療策略以綜合治療為主，其預后仍然很差，5年生存率徘徊在20％-30％左右。隨著胃癌相關(guān)的細胞生物學和分子生物學研究的不斷深入，針對腫瘤細胞生長、凋亡、細胞周期等分子生物靶點提出的分子靶向治療成為了胃癌綜合治療的迫切要求和研究熱點。
　　JAK2激酶是JAK家族

2、成員之一，許多研究表明，JAK2信號通路的異常活化與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如結(jié)腸癌、頭頸部癌、肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤等。目前，關(guān)于JAK2與胃癌的研究較少。我們課題組的前期工作結(jié)果顯示，JAK2可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，JAK2激酶小分子抑制劑可能用于胃癌的臨床治療，但需要深入的研究為其提供理論依據(jù)。
　　本研究將通過體內(nèi)外實驗闡明通過JAK2激酶小分子抑制劑AG490及特異性shRNA靶向沉默JAK2等方法

3、下調(diào)JAK2通路對胃癌細胞細胞增殖、凋亡等生物學行為的影響及其機制;并試圖揭示核JAK2信號通路對AG490治療胃癌的影響及其機制，以進一步闡明JAK2在胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及分子機制。
　　研究步驟:
　　1.JAK2在胃癌細胞系和組織中的表達情況及與胃癌各病理特征之間的相關(guān)性
　?、倜庖呓M織化學方法檢測75對原發(fā)性胃癌患者的胃癌組織及配對的癌旁非腫瘤胃粘膜組織中JAK2的表達及核漿分布情況;
　?、趯崟r

4、定量RT-PCR和Western blot檢測4株不同分化程度的胃癌細胞株MKN28、SGC7901、AGS、MKN45以及胃正常上皮來源的細胞株GES-1中JAK2及pJAK2的mRNA和蛋白表達水平;
　?、凼褂肧pearman's rho test分析JAK2表達水平與胃癌臨床各病理參數(shù)之間的相關(guān)性。
　　2.JAK2激酶小分子抑制劑AG490對胃癌細胞惡性生物學行為的影響
　?、費TS法檢測不同濃度的JAK2激

5、酶小分子抑制劑AG490作用胃癌細胞不同時間段對胃癌細胞增殖的影響;流式細胞術(shù)檢測AG490對胃癌細胞凋亡的影響;Westernblot檢測AG490對胃癌細胞凋亡及周期相關(guān)蛋白表達水平的影響;
　?、诮⒙闶笃は潞闪瞿Ｐ?，檢測AG490對胃癌細胞在裸鼠體內(nèi)生長的影響。
　　3.細胞核JAK2信號在AG490誘導的胃癌細胞凋亡中的作用及機制
　?、賅estern blot檢測不同分化程度胃癌細胞MKN28、SGC790

6、1、AGS、MKN45及胃上皮細胞GES-1中JAK2的核表達情況;
　?、赪estern blot檢測AG490對SGC7901和AGS細胞總蛋白、漿蛋白及核蛋白中JAK2及pJAK2表達水平的影響;應用細胞免疫熒光技術(shù)觀察AG490對胃癌細胞中JAK2的表達和分布情況的影響;
　　③采用免疫共沉淀技術(shù)驗證JAK2在SGC7901細胞核中形成JAK2-STAT3-Hes1復合物;
　?、苡^察Hes1 siRNA聯(lián)合A

7、G490處理對胃癌細胞SGC7901細胞形態(tài)的影響，并采用Caspase3/7活性檢測和流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡的情況。
　　4.特異性JAK2干擾對SGC7901細胞惡性生物學行為的影響及機制
　?、贅?gòu)建shRNA介導特異性JAK2沉默的胃癌SGC7901穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，采用qPCR和Westem blot檢測JAK2的mRNA和蛋白表達水平;
　　②采用克隆形成實驗和MTS實驗觀察JAK2沉默對SGC7901細胞增殖的影

8、響;
　?、鄄捎昧魇郊毎麅x檢測JAK2沉默對SGC7901細胞凋亡和細胞周期的影響;
　　④裸鼠皮下荷瘤模型觀察JAK2沉默對胃癌生長的影響。
　　5.特異性JAK2干擾聯(lián)合ERK抑制劑對SGC7901細胞的體內(nèi)外作用
　?、賅estem blot檢測JAK2 shRNA轉(zhuǎn)染介導的JAK2下調(diào)對SGC7901細胞中ERK1/2表達及活性的影響;
　?、谂c單獨應用JAK2 shRNA或ERK1/2抑制劑PD9

9、8059相比較，觀測JAK2 shRNA聯(lián)合PD98059對SGC7901細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響;
　?、叟c單獨應用JAK2 shRNA或ERK1/2抑制劑PD98059相比較，觀測JAK2 shRNA聯(lián)合PD98059對SGC7901細胞裸鼠皮下成瘤的生長的影響。
　　研究結(jié)果與結(jié)論
　　1.JAK2在胃癌中高表達，提示其可能起到促癌作用
　?、貸AK2在66.67％(50/75)的胃癌組織中呈高表達;

10、而且，75例胃癌組織的細胞漿中均可見JAK2的陽性表達，22例胃癌組織的細胞核中可見JAK2的陽性表達;
　?、贘AK2的表達水平與胃癌患者的性別、年齡、腫瘤直徑、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期無關(guān)(p＞0.05);
　　③胃癌細胞株MKN28、SGC7901、AGS和MKN45均有JAK2和pJAK2的陽性表達，其中SGC7901細胞表達水平最高;GES-1細胞中未見明顯pJAK2表達。
　　2.JAK2激酶小分

11、子抑制劑AG490的抗胃癌作用呈現(xiàn)細胞選擇性
　?、貯G490呈濃度和時間依賴性地抑制AGS細胞的生長(p＜0.05)，但AG490對SGC7901細胞的生長抑制僅表現(xiàn)為濃度依賴性(p＜0.05);
　?、贏G490引起AGS細胞發(fā)生顯著的細胞凋亡，但AG490并未引起SGC7901細胞出現(xiàn)顯著的細胞凋亡(p＞0.05);
　?、跘G490對SGC7901細胞的裸鼠皮下成瘤的生長無顯著抑制作用(p＞0.05)。

12、　　3.SGC7901細胞對AG490的促凋亡效應無應答可能與JAK2的核內(nèi)移有關(guān)
　?、傥赴┘毎闙KN28、SGC7901、AGS和MKN45的細胞核內(nèi)均能檢測到不同程度的JAK2和pJAK2的表達，而GES-1細胞核中未見pJAK2的表達;
　　②AG490下調(diào)了AGS細胞中JAK2的細胞核表達，但卻引起SGC7901細胞核蛋白中JAK2的表達的顯著升高;
　　③AG490促進SGC7901細胞核中JAK2-ST

13、AT3-Hes1復合物的形成，而Hes1 siRNA能抑制該復合物的形成;
　?、蹾es1 siRNA聯(lián)合AG490能顯著促進SGC7901細胞的凋亡(p＜0.05)。
　　4.JAK2 shRNA干擾介導的JAK2沉默能抑制SGC7901細胞的增殖，但無促進其凋亡的作用
　　①穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了JAK2 shRNA的胃癌細胞株SGC7901出現(xiàn)了JAK2基因沉默，即JAK2表達顯著下調(diào)(p＜0.05);
　?、贘AK2

14、沉默抑制SGC7901細胞增殖是通過引起G2/M期阻滯引起的，而不是通過促進細胞的凋亡;
　?、跩AK2沉默對SGC7901細胞的裸鼠皮下成瘤的生長無顯著抑制作用(p＞0.05)。
　　5.ERK1/2抑制能增強JAK2沉默誘導的抗胃癌作用
　?、貸AK2 shRNA轉(zhuǎn)染沉默JAK2的同時，顯著活化了ERK1/2;
　?、贘AK2沉默聯(lián)合ERK1/2抑制通過促進細胞凋亡和細胞周期阻滯發(fā)揮了有效的體內(nèi)外抗腫瘤細胞生