小分子抑制劑與Mc1-1蛋白作用模式及分子優(yōu)化的研究.pdf

1、Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白，二者通過BH3溝槽發(fā)生的相互作用來決定細胞是否凋亡。研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細胞的抗凋亡蛋白例如Mcl-1與Bcl-2蛋白的過量表達，使細胞逃避凋亡，獲得永生。因此抗凋亡蛋白是抗癌藥物研發(fā)的重要靶點。靶向Bcl-2抗凋亡蛋白的小分子抑制劑可以通過與抗凋亡蛋白的BH3溝槽結合，釋放出促凋亡蛋白，導致癌細胞的凋亡。Mcl-1和Bcl-2是抗凋亡蛋白的兩個典型代表，同時結合Bcl-2與Mcl-1蛋白，并拮抗兩

2、個蛋白的功能，是靶向Bcl-2家族小分子抑制劑的發(fā)展方向。由于Mcl-1的BH3溝槽與Bcl-2蛋白有一些差異，因此現(xiàn)有的Bcl-2小分子抑制劑多數(shù)不能同時與Mcl-1蛋白結合，通過研究小分子抑制劑與Mcl-1蛋白的結合模式，可以獲得Mcl-1蛋白BH3溝槽的特征性結構信息，指導Mcl-1抑制劑或者Mcl-1/Bcl-2雙抑制劑的分子設計，獲得親和力更好的抗癌先導分子。
　　首先我們構建了Mcl-1蛋白的表達質粒。通過優(yōu)化蛋白表達

3、的誘導條件，15N標記的Mcl-1蛋白的表達量達到7.9mg/L，與未標記Mcl-1蛋白的表達量(8.3 mg/L)相仿。通過鎳柱親和層析洗脫條件的優(yōu)化與分子篩層析，將蛋白的純度提高到了95％以上。圓二色譜結果顯示純化所得Mcl-1蛋白具有正確折疊的二級結構。同時蛋白NMR一維圖譜和二維圖譜結果顯示，15N標記的Mcl-1蛋白的譜峰分散良好，表明其高級結構正確，純化后的蛋白活性良好，滿足后續(xù)的二維核磁實驗的要求。
　　接著對本課題

4、組設計合成的小分子C1(2，3-dihydroxyanthracene-9，10-dione)進行分子對接實驗，獲得了Mcl-1蛋白中與C1的結合模式，發(fā)現(xiàn)C1與R263形成了氫鍵，C1的蒽醌骨架橫跨R263到p3口袋。然而，骨架末端的苯環(huán)指向Mcl-1蛋白的p3口袋但并未占據(jù)p3口袋。繼續(xù)設計了小分子C2（6-bromo-2，3-dihydroxyanthracene-9，10-dione），以占據(jù)Mcl-1蛋白的p3口袋。熒光偏振實

5、驗測得C2對Bcl-2以及Mcl-1蛋白Ki值分別為132 nM和107 nM，和C1親和力相比分別提高了三倍和四倍。1H-15N HSQC二維核磁結果表明C2結合于Mcl-1蛋白表面的BH3結合溝槽從，其中R263殘基的化學位移最大。C2的溴原子與Mcl-1蛋白p3口袋的F228殘基相互作用，分子對接實驗也直觀的證明了C2的溴原子占據(jù)了Mcl-1的p3口袋。隨后，在C2的基礎上設計了C3、C4、C5、C6，用硫原子替換溴原子，并在硫原

6、子上接上較長的取代基，以占據(jù)Mcl-1蛋白的p2口袋。熒光偏振實驗表明這四個小分子對Mcl-1蛋白和Bcl-2蛋白的親和力比C2均有明顯提升，特別是C6小分子(dihydroxy-6-(4-isopropylphenyl)thio)anthracene-9，10-dione)，其對Bcl-2和Mcl-1的Ki值分別是24 nM和13nM。與C1相比，分別提高了約13倍和38倍。HSQC實驗表明，除了在C2中發(fā)生化學位移的氨基酸，C6滴定