小分子類肽APN抑制劑的活性評(píng)價(jià)及其抗腫瘤作用機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，其死亡率僅次于心、腦血管類疾病。而導(dǎo)致癌癥患者死亡的一個(gè)重要原因是腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。在腫瘤的治療過(guò)程中，由于惡性腫瘤易于轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散等原因，至今尚無(wú)有效的治療方法。因此，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移成為治療惡性腫瘤的一個(gè)重要手段。
　　 腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，其中包括腫瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，血管壁的穿透以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，腫瘤組織新生血管生成等一系列過(guò)程。氨肽酶N(Aminope

2、ptidase N，APN，EC3.4.11.2)在此過(guò)程中起到了極其重要的作用。APN也被稱為CD13，是一種Ⅱ型膜結(jié)合型鋅離子依賴性金屬蛋白酶，最初是在鑒別人白血病分類的特異性標(biāo)記物時(shí)提到的。該蛋白的功能較為復(fù)雜，在不同的組織行使不同的功能，但主要與其蛋白水解活性有關(guān)。APN能水解寡肽，尤其是從小肽鏈的N端降解中性氨基酸，參與生物活性肽的激活或降解、腫瘤細(xì)胞侵襲時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)的降解、抗原呈遞細(xì)胞的抗原呈遞等多種生物學(xué)過(guò)程。因?yàn)锳PN分

3、布廣泛，其功能在很大程度上取決于其分布，在腸內(nèi)絨毛上緣，APN參與小肽的降解和氨基酸的清除；在突觸膜內(nèi)，APN能使內(nèi)啡肽和腦啡肽降解失活；在腎中，APN參與腎素-血管緊張素系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)，能降解血管緊張素Ⅲ。另外，APN還參與炎癥反應(yīng)，作為病毒受體介導(dǎo)病毒感染等。
　　 鑒于APN在腫瘤新生血管生成中的重要作用，該酶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在血管內(nèi)皮細(xì)胞中研究的較為活躍。在腫瘤微環(huán)境下，活化的內(nèi)皮細(xì)胞中APN的表達(dá)主要受血管生長(zhǎng)信號(hào)在轉(zhuǎn)錄水平上

4、的調(diào)節(jié)，APN的轉(zhuǎn)錄受到兩條Ras信號(hào)通路的調(diào)節(jié)：Ras/分裂素激活的蛋白激酶MAPK通路和3-磷脂酰肌醇激酶P13K通路。阻斷這兩條信號(hào)通路中的任意一條都不能完全抑制APN mRNA的轉(zhuǎn)錄，這兩條信號(hào)通路最終匯聚于Erk，抑制Erk才能完全抑制APN的表達(dá)。內(nèi)皮細(xì)胞中，胞內(nèi)信號(hào)通過(guò)磷酸化激活轉(zhuǎn)錄因子Ets-2，磷酸化的Ets-2結(jié)合APN基因的近端啟動(dòng)子，啟動(dòng)APN的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮生物學(xué)功能，調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能。APN蛋白的胞內(nèi)部分只

5、有8～10個(gè)氨基酸殘基，因此，一般認(rèn)為APN不能直接向胞內(nèi)傳遞信號(hào)，但APN的底物包括IL-6、IL-8、神經(jīng)肽、腦啡肽等，APN對(duì)這些底物的降解會(huì)一定程度上影響其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，至于APN是否還通過(guò)其它細(xì)胞因子影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，目前還不清楚。
　　 原發(fā)腫瘤或繼發(fā)腫瘤生長(zhǎng)到超過(guò)1～2 mm3時(shí)，就必須有新生血管生成提供足夠的血液供應(yīng)，新生血管生成是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，這包括受血管生長(zhǎng)因子刺激的內(nèi)皮細(xì)胞穿過(guò)基底膜侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖等過(guò)程，并

6、最終在腫瘤組織內(nèi)形成血管結(jié)構(gòu)。血管生成受多種腫瘤細(xì)胞或宿主細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，在腫瘤微環(huán)境中，內(nèi)皮細(xì)胞APN mRNA和蛋白水平都有上調(diào)，用抗APN的單克隆抗體或功能性抑制劑如Bestatin，能顯著的抑制毛細(xì)管網(wǎng)絡(luò)的形成，這表明此金屬蛋白酶在新血管生成后期是一個(gè)重要的血管生成激活劑。細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分是多糖和纖維蛋白，因此，通過(guò)以膠原和蛋白聚糖為基本骨架的纖維網(wǎng)狀復(fù)合物，細(xì)胞外基質(zhì)將細(xì)胞外與細(xì)胞內(nèi)連成一個(gè)有機(jī)的整體，這對(duì)維持細(xì)

7、胞連接的穩(wěn)定性和細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都起到了非常重要的作用。同時(shí)這對(duì)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也設(shè)置了障礙，因此基底膜的降解是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，APN因其蛋白水解活性在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲過(guò)程中起非常重要的作用。細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型膠原就是APN的底物，在非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌中，APN的表達(dá)可能導(dǎo)致患者預(yù)后較差，并且推測(cè)APN表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散存在相關(guān)性。
　　 另外，APN還參與了免疫調(diào)節(jié)過(guò)程和病毒的感染。目前已知AP

8、N能通過(guò)降解抗原肽N端的數(shù)個(gè)氨基酸干擾抗原呈遞；在造血系統(tǒng)中，細(xì)胞表面的APN能調(diào)節(jié)細(xì)胞的局部微環(huán)境影響造血細(xì)胞的分化。病毒感染細(xì)胞的過(guò)程需要細(xì)胞表面受體的介導(dǎo)，而APN正是多種病毒的細(xì)胞表面受體，病毒與受體結(jié)合后，引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用，病毒得以進(jìn)入細(xì)胞。
　　 鑒于以上原因，本研究課題致力于篩選靶向APN的抗腫瘤先導(dǎo)化合物。通過(guò)一系列試驗(yàn)，評(píng)價(jià)了各受試化合物的抗腫瘤活性，并最終篩選得到化合物13f作為APN抑制劑類先導(dǎo)化合物進(jìn)行

9、研究、開發(fā)。APN抑制劑的抗腫瘤機(jī)制一直不清楚，本課題還初步研究了APN抑制劑的抗腫瘤作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Fascin蛋白在APN抑制劑的抑制細(xì)胞遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，我們還發(fā)現(xiàn)不同物種來(lái)源的氨肽酶N空間結(jié)構(gòu)對(duì)APN抑制劑的活性評(píng)價(jià)存在影響。因此，對(duì)化合物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)以人源氨肽酶N進(jìn)行最終的評(píng)價(jià)?，F(xiàn)將各部分的主要內(nèi)容介紹如下：
　　 第一部分 APN抑制劑的活性評(píng)價(jià)本部分內(nèi)容，主要從分子和細(xì)胞水平上研究本實(shí)驗(yàn)室首次設(shè)計(jì)合

10、成的環(huán)酰亞氨類APN抑制劑的生物活性。小分子環(huán)酰亞胺類肽是基于APN為作用靶點(diǎn)而設(shè)計(jì)合成的一系列APN抑制劑類抗癌先導(dǎo)化合物，其設(shè)計(jì)思想結(jié)合了肽類似物和構(gòu)象限制原則，并且此類化合物的藥效團(tuán)結(jié)構(gòu)與Bestatin較為相似。另外，APN的功能與血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲密切相關(guān)，而受試化合物也確實(shí)能抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成及腫瘤細(xì)胞的侵襲。
　　 首先，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了不同腫瘤細(xì)胞APN的表達(dá)情況，結(jié)果表明：人髓性白血病細(xì)胞HL-6

11、0、人卵巢透明細(xì)胞癌ES-2、人肺泡上皮細(xì)胞癌A549、人肝癌細(xì)胞PLC/PRF/5 APN表達(dá)量相對(duì)較高，人肝癌細(xì)胞HepG2、H7402、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞A172、U87 APN表達(dá)量相對(duì)較低，而人髓性白血病細(xì)胞K562不表達(dá)APN或表達(dá)量非常低。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)及文獻(xiàn)報(bào)道，我們選用HL-60、ES-2細(xì)胞檢測(cè)APN抑制劑的活性。
　　 根據(jù)本課題組李乾斌博士測(cè)定的酶活性數(shù)據(jù)，我們選出一系列化合物，用細(xì)胞模型評(píng)價(jià)了其抗腫瘤活性。MT

12、T試驗(yàn)結(jié)果表明，所有化合物均能夠在一定程度上抑制HL-60細(xì)胞的活力，結(jié)合抑酶活性數(shù)據(jù)及細(xì)胞活力抑制數(shù)據(jù)，我們篩選出三個(gè)化合物：13d、13f、22f，做進(jìn)一步的活性評(píng)價(jià)，檢測(cè)了抑制劑對(duì)HL-60細(xì)胞表面APN的抑酶活性；受試化合物對(duì)卵巢癌ES-2、肺癌A549細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明受試化合物均能明顯的抑制APN的活性及腫瘤細(xì)胞的活力。另外，根據(jù)氨肽酶N的生物學(xué)功能，我們還檢測(cè)了這三個(gè)化合物對(duì)細(xì)胞周期、血管生成及腫瘤細(xì)胞侵襲的影響。受

13、試化合物均能明顯的影響HL-60細(xì)胞有絲分裂；抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)血管生成及卵巢癌ES-2細(xì)胞侵襲。但對(duì)低表達(dá)APN的K562細(xì)胞的活力影響不大，這表明受試化合物對(duì)APN具有一定的選擇性。另外，我們還測(cè)定了受試化合物對(duì)APN的抑制常數(shù)；應(yīng)用計(jì)算機(jī)SYBYL軟件做了分子動(dòng)力學(xué)模擬，構(gòu)建了3D-QSAR模型，用于分析抑制劑的構(gòu)效關(guān)系并指導(dǎo)新的APN抑制劑的合成。
　　 綜合所有活性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，我們選定化合物13f開發(fā)潛力

14、最大，可能成為新的APN抑制劑類抗腫瘤藥物。該研究結(jié)果發(fā)表在Fundam Clin Pharmacol.2010 Jul15上。
　　 第二部分 APN抑制劑抗腫瘤細(xì)胞遷移機(jī)制的研究Fascin也被稱為Fascin1，是一種能與肌動(dòng)蛋白結(jié)合的球狀蛋白，該蛋白主要把肌動(dòng)蛋白絲組織成嚴(yán)密的束構(gòu)成層狀粘足和絲狀偽足，而這兩種結(jié)構(gòu)是細(xì)胞突觸的主要成分，細(xì)胞突觸在細(xì)胞感應(yīng)外部環(huán)境、細(xì)胞遷移時(shí)起非常重要的作用，因此，在細(xì)胞遷移過(guò)程中，F(xiàn)as

15、cin是一個(gè)非常重要的蛋白。在許多癌癥中Fascin表達(dá)都上調(diào)，例如：胃癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌。因此，F(xiàn)ascin已成為一個(gè)新型的候選腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
　　 本部分內(nèi)容主要研究陽(yáng)性對(duì)照藥(Bestatin)和我們首次合成的(13f)APN抑制劑的抗腫瘤細(xì)胞遷移機(jī)制，本研究首次發(fā)現(xiàn)Fascin表達(dá)下降與APN抑制劑的抑制遷移活性有關(guān)。MAPK信號(hào)通路中Erk1/2的磷酸化也受APN抑制劑的時(shí)間、濃度依賴性影響。然而，MAP

16、K信號(hào)通路阻斷劑PD98059并不能抑制Fascin的表達(dá)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)APN抑制劑通過(guò)P13K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)MMP-2的表達(dá)。
　　 在試驗(yàn)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)APN抑制劑對(duì)高表達(dá)APN的卵巢癌ES-2細(xì)胞的形態(tài)有影響，加藥處理后細(xì)胞變的細(xì)長(zhǎng)，類似于成纖維細(xì)胞，而對(duì)于低表達(dá)APN的肝癌HepG2細(xì)胞，影響不大。細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞骨架密切相關(guān)，因此我們推測(cè)，細(xì)胞遷移速率也會(huì)隨細(xì)胞骨架而受到影響。劃痕試驗(yàn)結(jié)果表明Bestatin

17、和13f均能明顯的抑制ES-2細(xì)胞的遷移，Bestatin較13f活性高。隨后，我們用Western blot試驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Fascin的表達(dá)情況。結(jié)果表明，APN抑制劑抑制卵巢癌ES-2細(xì)胞遷移的同時(shí)，F(xiàn)ascin的表達(dá)也受到了影響，為了確認(rèn)Fascin是否在APN抑制劑抑制細(xì)胞遷移過(guò)程中起重要作用，我們構(gòu)建了pcDNA3.1-Fascin質(zhì)粒，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空質(zhì)粒的對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)Fascin確實(shí)能影響APN抑

18、制劑的抑制細(xì)胞遷移作用。因此，綜合相關(guān)數(shù)據(jù)，我們得出結(jié)論：APN抑制劑是通過(guò)抑制Fascin蛋白的表達(dá)抑制卵巢癌ES-2細(xì)胞的遷移。
　　 大鼠乳腺上皮細(xì)胞Con8中，TGF-α能通過(guò)MEK-MAPK依賴性的通路抑制地塞米松對(duì)Fascin的下調(diào)作用，因此我們猜測(cè)APN抑制劑是否也通過(guò)MAPK信號(hào)通路下調(diào)Fascin。然而，Western blot結(jié)果表明盡管APN抑制劑能以時(shí)間、濃度依賴性的方式抑制Erk1/2的磷酸化，但MEK

19、抑制劑PD98059并不能抑制卵巢癌ES-2細(xì)胞Fascin的表達(dá)。因此，卵巢癌ES-2細(xì)胞中，F(xiàn)ascin的表達(dá)不受MAPK信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。另外，我們發(fā)現(xiàn)APN抑制劑能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2 mRNA、蛋白的水平，并且APN抑制劑也能上調(diào)Akt磷酸化，同時(shí)P13K激酶特異性抑制劑LY294002不僅能阻斷P13K依賴的Akt磷酸化，還能濃度依賴性的抑制MMP-2的表達(dá)，所有這些數(shù)據(jù)都表明APN抑制劑可以通過(guò)P13K/Akt信號(hào)通

20、路上調(diào)MMP-2的表達(dá)。該研究結(jié)果已投稿。
　　 第三部分不同物種來(lái)源的氨肽酶N空間結(jié)構(gòu)對(duì)APN抑制劑活性評(píng)價(jià)的影響本課題組合成的新型APN抑制劑161可以明顯的抑制豬氨肽酶N的活性，且抑制常數(shù)也與陽(yáng)性藥Bestatin相當(dāng)。然而，我們用人腫瘤細(xì)胞檢測(cè)其活性時(shí)，161并不能有效的抑制氨肽酶N的活性及細(xì)胞活力、細(xì)胞遷移和侵襲。兩個(gè)化合物抑制小鼠APN活性時(shí)，抑制率也相差較大。另外，我們用HPLC檢測(cè)，161并沒(méi)有被細(xì)胞降解。因此，

21、我們推測(cè)可能是由于不同物種來(lái)源的APN三維空間結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致兩個(gè)化合物的抑酶活性相差較大。借助計(jì)算機(jī)輔助分子模擬分析表明，由于空間結(jié)構(gòu)上的不同，化合物161在人和豬APN結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合方式存在較大差別。因此，用豬氨肽酶N進(jìn)行APN抑制劑的活性篩選只能作為初篩手段，而真正的活性評(píng)價(jià)應(yīng)以人氨肽酶N作為酶源。該研究結(jié)果發(fā)表在Biol.Pharm.Bull.2010 Oct；33(10)上。
　　 結(jié)論
　　 本研究首先評(píng)價(jià)了一

22、系列APN抑制劑的活性，并從中選出三個(gè)較有潛力的化合物進(jìn)行后續(xù)的研究，通過(guò)多種活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，最終選定化合物13f活性較好，有望作為APN抑制劑類抗腫瘤先導(dǎo)物進(jìn)行開發(fā)。我們還對(duì)APN抑制劑的抗腫瘤細(xì)胞遷移機(jī)制，進(jìn)行了初步的探討。研究發(fā)現(xiàn)Fascin在腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中起到了非常重要的作用，APN抑制劑也正是通過(guò)抑制Fascin的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞遷移。對(duì)信號(hào)通路的研究表明，APN抑制劑對(duì)MAPK、P13K/Akt信號(hào)通路均有影響，通過(guò)P1

23、3K/Akt通路，APN抑制劑能上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，由于空間結(jié)構(gòu)上的不同，APN抑制劑與人和豬氨肽酶N的結(jié)合方式存在較大差別。因此，用豬氨肽酶N進(jìn)行APN抑制劑的活性篩選只能作為初篩手段，而真正的活性評(píng)價(jià)應(yīng)以人氨肽酶N作為酶源。上述研究篩選到一個(gè)活性較高、新合成的APN抑制劑，并對(duì)APN抑制劑的抗腫瘤細(xì)胞遷移機(jī)制進(jìn)行了初步探討，這對(duì)合成新型的APN抑制劑，以及腫瘤治療，提供了一定的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。