菌株Dyella ginsengisoli LA-4降解聯(lián)苯及基因的克隆與表達(dá).pdf

1、本論文旨在考察1株新分離的Dyella屬菌株LA-4對(duì)聯(lián)苯的降解特性并對(duì)其代謝基因進(jìn)行分子遺傳學(xué)研究。對(duì)菌株LA-4進(jìn)行生理生化、Biolog分析及16S rDNA分子鑒定，考察其生長(zhǎng)及降解聯(lián)苯的特性，推測(cè)出菌株LA-4降解聯(lián)苯的途徑；將該菌株作為生物強(qiáng)化制劑進(jìn)行生物強(qiáng)化降解聯(lián)苯的研究，采用PCR-DGGE分子指紋技術(shù)對(duì)強(qiáng)化體系進(jìn)行微生物群落動(dòng)態(tài)解析；利用染色體步移法擴(kuò)增得到完整的bph基因簇，并對(duì)其中的bphA1A2、bphA3、bp

2、hA4、bphB、bphC和mfphA基因進(jìn)行克隆和表達(dá)。 菌株LA-4是一株新的聯(lián)苯降解菌，結(jié)合生理生化鑒定、菌株的形態(tài)觀察、Biolog鑒定及16S rDNA序列分析，菌株LA-4歸屬于變形細(xì)菌γ亞類(lèi)，Dyella屬ginsengisoli菌種。菌株LA-4已作為專(zhuān)利菌種保存于中國(guó)普通微生物菌種保藏中心，注冊(cè)編號(hào)為：CGMCC No.2723。菌株LA-4與Dyella ginsengisoli Gsoil3046T(=D

3、SM18387T)的16SrDNA序列相似性高達(dá)98.22％，其16S rDNA序列登錄GenBank，注冊(cè)號(hào)為：EF191354。 菌株LA-4對(duì)卡那霉素和鏈霉素具有抗性，對(duì)其它所試抗生素均無(wú)抗性。菌株LA-4的最適生長(zhǎng)與降解條件為30℃，pH=6.0，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。加入的表面活性劑Tween-80濃度小于40 mg/L時(shí)會(huì)促進(jìn)菌株LA-4對(duì)聯(lián)苯的降解；菌株在生長(zhǎng)降解過(guò)程中可以耐受3％的鹽度；菌株具有抗金屬離

4、子Zn2+的能力。菌株LA-4的粗酶具有2，3-二羥基聯(lián)苯1，2-雙加氧酶活性，且為組成酶。聯(lián)苯在菌株LA-4的作用下，有黃色中間產(chǎn)物產(chǎn)生，苯環(huán)發(fā)生了間位斷裂反應(yīng)。LC-MS分析中檢測(cè)到主要降解中間產(chǎn)物為2-羥基-6-氧-6-苯基己二烯酸(HOPDA)和苯甲酸。 將菌株LA-4的游離態(tài)細(xì)胞投加到聯(lián)苯處理系統(tǒng)中進(jìn)行生物強(qiáng)化降解研究，結(jié)果表明投加菌株LA-4的游離態(tài)細(xì)胞可以縮短處理系統(tǒng)的啟動(dòng)時(shí)間，投加不同接種量對(duì)強(qiáng)化效果有顯著影響

5、，投配比為3.96％的系統(tǒng)顯示出最強(qiáng)的處理效果，在進(jìn)水聯(lián)苯濃度為500-1000 mg/L時(shí)，處理效果穩(wěn)定。利用PCR-DGGE對(duì)強(qiáng)化體系進(jìn)行微生物群落動(dòng)態(tài)解析，結(jié)果表明活性污泥體系和投配比為1.98％的系統(tǒng)隨著體系的不斷運(yùn)行，微生物的多樣性逐漸降低；當(dāng)進(jìn)水聯(lián)苯濃度逐漸升高時(shí)，投配比為1.98％的系統(tǒng)中，強(qiáng)化菌逐漸消失。而在投配比為3.96％的系統(tǒng)中可證明體系中始終有強(qiáng)化菌LA-4的存活。 利用染色體步移的方法從菌株LA-4的

6、基因組DNA中擴(kuò)增得到完整的bph基因簇，全長(zhǎng)為12，186 bp，全序列登錄GenBank，序列號(hào)為EU258607。對(duì)整個(gè)基因簇進(jìn)行解析，結(jié)果表明基因排列順序?yàn)閎phA1A2-ORF1-bphA3A4BCXOX1-ORF2-bphX2X3D，其中12個(gè)基因出現(xiàn)在已報(bào)道的bph基因簇中，ORF2基因首次在bph基因簇中發(fā)現(xiàn)，位于bphX1和bphX2基因之間。根據(jù)基因排列特點(diǎn)，說(shuō)明其屬于LB400型bph基因簇。ORF2基因與菌株P(guān)s

7、eudomonas putida UCC22(BAB62053)中編碼2-羥基粘康酸半醛水解酶(2-hydroxymuconic semialdehyde hydrolase)的基因相似性最高，確定其為編碼芳環(huán)間位斷裂產(chǎn)物水解酶的基因，命名為mfphA。菌株LA-4中的聯(lián)苯降解酶與其他已知的相應(yīng)酶的氨基酸序列相似性較低，最高相似性均在63-89％之間。 將bphA1A2、bphA3、bphA4、bphB和bphC基因在大腸桿菌

8、BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)。菌株LA-4聯(lián)苯雙加氧酶(BPDOLA-4)基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠轉(zhuǎn)化聯(lián)苯/多氯聯(lián)苯等物質(zhì)，以聯(lián)苯為底物時(shí)，酶的比活性最高，為134.9 nmol NADH/min(mg protein)。BPDOLA-4對(duì)底物的選擇性按以下順序：聯(lián)苯>4-氯聯(lián)苯>2，5-二氯聯(lián)苯>2,2'-二氯聯(lián)苯>2，5,2'-三氯聯(lián)苯>3，3’-二氯聯(lián)苯>2，5，3’-三氯聯(lián)苯>4，4’-二氯聯(lián)苯>2，5，4’-三氯聯(lián)苯。實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到

9、聯(lián)苯雙加氧酶轉(zhuǎn)化2,2'，5，5’-四氯聯(lián)苯的活性。實(shí)驗(yàn)表明BPDOLA-4還具有轉(zhuǎn)化二苯并呋喃和黃烷酮的活性。通過(guò)GC-MS和紫外可見(jiàn)光譜分析確定了菌株LA-4的聯(lián)苯雙加氧酶在轉(zhuǎn)化聯(lián)苯及多氯聯(lián)苯時(shí)僅存在2，3-位雙加氧活性，而未發(fā)現(xiàn)其具有3，4-位加氧活性。 通過(guò)對(duì)BphC_LA-4的氨基酸序列分析，說(shuō)明BphC_LA-4為雙域的I類(lèi)Fe(Ⅱ)依賴(lài)型外二醇雙加氧酶。利用AKTA蛋白質(zhì)層析儀對(duì)bphC基因在大腸桿菌中的表達(dá)產(chǎn)物

10、進(jìn)行純化。純化后的BphC_LA-4可以催化鄰苯二酚類(lèi)物質(zhì)的間位開(kāi)環(huán)反應(yīng)，以2，3-二羥基聯(lián)苯為底物時(shí)，酶的比活最高，為118.3 U/mg，酶反應(yīng)的最適pH為8.0，最佳溫度為40℃。BphC_LA-4對(duì)催化底物的選擇性按以下順序：2，3-二羥基聯(lián)苯>3-甲基鄰苯二酚>鄰苯二酚>4-氯鄰苯二酚>4-甲基鄰苯二酚。 根據(jù)MfphA的氨基酸序列分析和三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬的結(jié)果，說(shuō)明mfphA基因所編碼的酶屬于α/β水解酶家族，可以在單環(huán)

11、芳香化合物降解過(guò)程中水解芳環(huán)間位開(kāi)環(huán)產(chǎn)物。將mfphA基因在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，并利用AKTA蛋白質(zhì)層析儀對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化。純化后的MfphA可以水解單環(huán)芳香化合物間位斷裂產(chǎn)物，以2-羥基-6-氧-2，4-己二烯酸(HODA)為底物時(shí)酶的比活性最高，為2.0 U/mg；酶反應(yīng)的最適pH為7.0，最佳溫度為70℃，可以長(zhǎng)期于低溫下保存。MfphA對(duì)催化底物的選擇性按以下順序：6-methyl-HODA>HODA>5-