堿性纖維素酶高產(chǎn)菌株的篩選及其基因的克隆與表達.pdf

1、纖維素作為一種豐富的可再生資源，可通過酶降解的方法轉(zhuǎn)化為易發(fā)酵的糖類，從而生產(chǎn)酒精或其他產(chǎn)品。纖維素酶是這一轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶之一。為了獲得一株纖維素酶的高效基因工程菌，本研究通過以下試驗獲得了如下結(jié)果： 1.應(yīng)用剛果紅染色鑒定和粗酶液活力測定相結(jié)合的篩選方法，從腐爛的紙漿中篩選到一株高活力堿性纖維素酶產(chǎn)生菌Bacillussp.CY1-3。該菌為芽孢桿菌，適宜在pH6.2～8.8、溫度34～46℃下生長。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫

2、度、pH分別為34～43℃、7.8～8.8，培養(yǎng)36h左右達到產(chǎn)酶高峰。酶反應(yīng)的最適溫度為60℃，pH為5.5～8，并具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，Cu2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+對酶活力具有促進作用，而Co2+和Zn2+表現(xiàn)明顯的抑制作用。該菌產(chǎn)生單一的內(nèi)切葡聚糖酶，在最佳條件下CMCase活力可達13.6U/mL。這種酶制劑洗滌劑在工業(yè)中具有良好的應(yīng)用前景。 2.將菌株Bacillussp.CY1-3基因組DNA用

3、限制性內(nèi)切酶Sau3AI部分消化，分離2～7kb的片段連接到用BamHI完全消化的克隆載體pBluSKM上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建其基因組DNA部分文庫。應(yīng)用剛果紅染色檢測酶活性的方法，從近10萬個克隆子中篩選出出6個表現(xiàn)纖維素酶活性的陽性克隆子。限制性內(nèi)切酶切分析，6個克隆子表現(xiàn)為一致的圖譜，視其為相同克隆子。 3.Bacillussp.CY1-3菌株纖維素酶基因克隆片段的序列分析表明：質(zhì)粒pGJc-1上2189bp的插

4、入片段中有一個由1593個核苷酸組成的開放閱讀框，命名為celC。在其推測的起始密碼子ATG的上游相隔5bp處有一個潛在的核糖體結(jié)合位點AGGAGT，該序列可使mRNA和細菌核糖體16SrRNA的3'端堿基互補配對。在ORF的上游64bp處發(fā)現(xiàn)了一個可能的啟動子序列，即-35區(qū)的TAGACA和-10區(qū)為TATAAT，兩者相隔18bp，該序列與大腸桿菌的σ70所識別的保守的啟動序列十分相似。 4.CelC蛋白分析表明，CelC由

5、531個氨基酸殘基組成，預(yù)計分子量大小為58,351道爾頓，等電點為10.18。將CelC蛋白氨基酸序列與GeneBank中已公布的氨基酸序列對比分析，結(jié)果表明該蛋白與多種細菌的β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶具有很高的同源性。通過NCBI的保守結(jié)構(gòu)域檢索，CelC有一個位于N端66～320AA之間，屬于糖基水解酶家族5的催化結(jié)構(gòu)域；一個位于C端391～472AA家族3碳水化合物結(jié)合組件。 5.將含纖維素酶基因的重組克隆載體pGJc-

6、1進行亞克隆，用BamHI和SacⅠ雙酶切后，插入到表達載體pET-28a(+)內(nèi)，構(gòu)建成氨基端攜帶His-6標簽的重組表達載體pGJc-8，在大腸桿菌BL21中用IPTG進行誘導(dǎo)表達，粗酶液酶活力達89U/mL，為出發(fā)菌株的6.5倍。 6.蛋白質(zhì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)合酶活力圖譜研究表明：在大約58kD處有蛋白表達帶并具有纖維素酶活力，且分子量與理論值一致。 7.采用固化的Ni2+凝膠，對發(fā)酵的粗蛋白進行了親