長梗木霉外切纖維素酶基因的克隆及其表達.pdf

1、本研究對一株纖維素酶高產菌株XST1進行ITS分子標記鑒定，接著克隆了該菌的兩個外切纖維素酶基因cbh I和cbh II，進一步實現(xiàn)了外切纖維素酶基因在畢赤酵母中的有效表達。外切纖維素酶基因的克隆及其表達，豐富了現(xiàn)有的纖維素酶基因資源，也為該基因的進一步改造奠定了初步的分子基礎。主要的研究內容和成果包括： (1)XST1菌株的分子鑒定：克隆并測定XST1菌株的ITS序列，通過比對和聚類分析，構建系統(tǒng)進化樹，結果表明該菌株與長梗木

2、霉(Trichodermalongibrachiatum)親緣關系最為緊密，初步鑒定為長梗木霉。 (2)外切纖維素酶的基因組DNA和cDNA的克隆及序列分析：提取XST1的基因組DNA和總RNA，參照里氏木霉和綠色木霉相關基因序列設計引物，采用PCR和RT-PCR技術分別擴增了外切纖維素酶I、II的全長基因序列和cDNA序列。序列分析結果表明：cbh I基因長1681 bp，含2個內含子(462-527 bp和1226-1294

3、 bp)；cbh II基因全長1583 bp，含3個內含子(93-143 bp、528-583bp和832-894bp)。 (3)基因工程菌的構建：將cbh-cDNA序列插入表達載體pPIC3.5K，通過電擊轉化的方式導入畢赤酵母GS115菌株。重組菌株經0.5％甲醇誘導培養(yǎng)，實現(xiàn)了外切纖維素酶蛋白的分泌表達。SDS-PAGE分析表明，表達的酶蛋白分子量約為65kDa和67kDa左右。CMC檢測平板中出現(xiàn)透明水解圈，工程菌發(fā)酵上

4、清液水解CMC的最大酶活分別為26.40 U/mL和24.70 U/mL，水解pNPC的最大酶活分別為28.89 U/L和26.39 U/L。纖維素酶廣泛應用于食品、飼料、服裝紡織、洗滌、造紙等工業(yè)領域中。在纖維素燃料乙醇的生產中，纖維素酶具有巨大的應用價值和經濟前景。但應用天然微生物生產纖維素酶存在許多問題，如各酶組分比例不合理、酶產量低、活性低、質量不穩(wěn)定等，這些問題都極大的影響了纖維素酶的生產和應用，因此亟需尋找新的菌種資源或對其

5、進行改造，以提高纖維素酶的使用效果，拓展其在不同領域的應用范圍。目前對纖維素酶產生菌的研究多集中在真菌的木霉屬，其中里氏木霉(Trichoderma reesei)、康寧木霉(Trichoderma koningii)等研究的最為透徹，對長梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)的研究則很少見報道。 本研究首先對一株纖維素酶高產菌株XST1進行分子鑒定，采用CTAB法提取該菌的菌絲體總DNA，設計真菌IT

6、S序列通用引物，進行PCR擴增，回收PCR產物，將回收片段連接到pMD18-T simple載體，轉化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中，應用氨卞抗性平板篩選陽性克隆子，然后送交測序。測序結果經拼接、去載體后得到該菌的ITS序列為638bp，GenBank登錄號為FJ528078。利用軟件Clustalx1.83對該菌ITS序列和GenBank中現(xiàn)有的部分序列進行比對與聚類分析，并運用Mega4軟件構建系統(tǒng)進化樹。結果表明該菌與報道的長梗木霉親緣關

7、系最為緊密，所以我們將該菌命名為Trichoderma longibrachiatum XST1。 為得到Trichoderma longibrachiatum XST1單一外切纖維素酶組分，研究其與其他酶組份共同降解纖維素的機理以及與其他纖維素酶組份以一定比例進行復配來滿足其在不同工業(yè)生產中的應用，我們進一步克隆了該菌的外切纖維素酶(CBH)基因及其cDNA，并實現(xiàn)了該外切纖維素酶基因在畢赤酵母中的表達，主要研究內容及成果如下

8、： 1.外切纖維素酶基因的基因組DNA和cDNA的克隆及序列分析 參照NCBI基因庫中外切纖維素酶相關基因序列序列設計引物。采用CTAB法提取長梗木霉XST1菌株的基因組DNA，Trizol法提取該菌株的總RNA。分別以基因組和總RNA為模板，應用PCR、RT-PCR方法擴增cbh全長基因組序列和cDNA序列。PCR產物經回收后，連接到pMD18-T simple載體，轉化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中，應用氨卞抗性平

9、板篩選陽性克隆子，經PCR驗證正確后送交上海生工測序部測序，獲得了該菌的cbh全長基因組序列和cDNA序列。 cbh I測序結果表明：以基因組DINA為模板得到的cbh I全長序列為1681 bp，而以cDNA為模板得到的cbh I序列為1545bp。序列比對后發(fā)現(xiàn)：cbh I-DNA的426-527 bp和1226-1294 bp的位置為內含子序列，將cbh I-DNA與NCBI數據庫中的序列進Blast同源檢索，發(fā)現(xiàn)它與綠色

10、木霉(Trichoderma viride)cbh I序列同源性高達91％。cbh I-cDNA基因序列提交GenBank，其登錄號為FJ026620。cbh I基因編碼514個氨基酸，與其他同源的CBH I蛋白具有高度的序列相似性。其中第1-18個氨基酸殘基為信號肽序列，第19-448位氨基酸殘基為催化結構域(CatalyticDomain，CD)，第482-514個氨基酸殘基為纖維素結合結構域(Cellulose BindingDo

11、main，CBD)，該酶的活性中心可能為Glu229、Asp231、Glu234位的三個氨基酸殘基。 cbh II測序結果表明：以基因組DNA為模板得到的cbh II全長1583 bp，而以cDNA為模板得到的cbh II為1413 bp。序列比對后發(fā)現(xiàn)：94-144 bp，529-584 bp和832-894 bp的位置為內含子。將cbh II-DNA與NCBI數據庫中的序列進Blast同源檢索，發(fā)現(xiàn)它與康氏木霉(Hypocr

12、ea koningii)cbh II序列同源性達100％。該基因序列已提交GenBank，登錄號為FJ026621。cbh II基因編碼470個氨基酸，與其他同源CBH II蛋白具有高度的序列相似性。CBH II的第1-24個氨基酸殘基為信號肽序列，第31-62個氨基酸殘基為CBD區(qū)域，第123-436位氨基酸殘基為CD區(qū)域，其活性位點可能為Asp198、Asp244、Asp424位的三個天冬氨酸殘基。 2.cbh-cDNA基因

13、表達載體的構建 (1)cbh I-cDNA基因表達載體的構建 將克隆在pMD18-T載體上的cbh I-cDNA基因片段，先用限制性內切酶AVR II單酶切，回收酶切產物，再用Not I進行第二次酶切，回收二次酶切產物。表達載體pPIC3.5K載體也用這兩個酶進行分步酶切后進行回收。用T4 DNA連接酶連接回收的基因片段和表達載體pPIC3.5K，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，通過卡那霉素平板篩選克隆子，再經菌落PCR

14、、質粒酶切及測序等方法驗證插入片段的大小和閱讀框的正確性，將驗證為正確的重組質粒命名為pPIC3.5K-cbh I。 (2)cbh II-cDNA基因表達載體的構建 將克隆在pMD18-T載體上的cbh II-cDNA基因片段，用EcoR I和Not I雙酶切，回收基因片段。表達載體pPIC3.5K載體也用同樣的兩個酶雙酶切后回收。用T4 DNA連接酶連接回收的基因片段和表達載體pPIC3.5K，轉化大腸桿菌DH5α感受

15、態(tài)細胞，通過卡那霉素抗性平板篩選克隆子，再經菌落PCR、質粒酶切及測序等方法驗證插入片段的大小和閱讀框的正確性，將驗證正確的重組質粒命名為。pPIC3.5K-cbh II。 3.cbh-cDNA基因的表達 通過電轉化方法將重組質粒轉化至畢赤酵母GS115中，涂布到MD平板上培養(yǎng)，待長出菌落后，利用PCR法篩選酵母重組菌株，并對篩選為陽性的酵母重組菌株在BMMY中用0.5％濃度的甲醇進行誘導培養(yǎng)，發(fā)酵上清液在CMC酶活驗證

16、板中均出現(xiàn)了透明水解圈，分別以CMC和。pNPC為底物，測定發(fā)酵上清液中的外切纖維素酶的酶活，同時濃縮發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE，分析重組蛋白的表達情況。其中外切纖維素酶I的CMC酶活最高為26.40 U/mL，pNPC酶活最高為28.89U/L，兩者均出現(xiàn)在72小時；外切纖維素酶II的CMC酶活最高為24.70 U/mL，pNPC酶活最高為26.39 U/L，兩者均出現(xiàn)在96小時。SDS-PAGE檢測時陰性對照泳道均無相應條帶出現(xiàn)