半纖維素酶基因的克隆表達(dá)及協(xié)同酶解竹半纖維素的研究.pdf

1、半纖維素結(jié)構(gòu)成分復(fù)雜，除了由木聚糖、甘露聚糖等組成的主鏈外，還含有不同側(cè)鏈取代基，如D-半乳糖基、4-O-甲基葡萄糖醛酸等。因此半纖維素的徹底降解需要多種酶的協(xié)同作用。本課題組已經(jīng)從黑曲霉BE-2中表達(dá)了阿拉伯糖苷酶。本論文從東方肉座菌EU7-22中克隆表達(dá)了GH10家族的木聚糖酶，同時(shí)還從A.niger BE-2中克隆并表達(dá)了GH67家族α-葡萄糖醛酸酶，并利用這兩種酶和阿拉伯糖苷酶對(duì)竹屑半纖維素進(jìn)行協(xié)同酶解研究。主要結(jié)果如下:

2、>　　(1)從東方肉座菌EU7-22中首次成功克隆獲得了一GH10家族的木聚糖酶基因xynⅢ,成功構(gòu)建了木聚糖酶Ⅲ重組菌并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的高效表達(dá)，該重組菌株在誘導(dǎo)培養(yǎng)168 h后粗酶液的木聚糖酶可達(dá)到127.5 IU/mL。該酶催化最適pH為6.0，最適反應(yīng)溫度為65℃，在50℃下熱穩(wěn)定性較好;該酶對(duì)小麥阿拉伯木聚糖(WAX)、山毛櫸木聚糖(BWX)和燕麥木聚糖(OSX)具有較高的酶活性以及親和力，其底物特異性酶活分別為582

3、IU/mg、450 IU/mg和405 IU/mg酶蛋白。
　　同時(shí)研究了木聚糖酶XYNⅢ對(duì)低聚木糖的作用方式，該酶能夠?qū)⒛救恰⒛舅奶?、木五糖以及木六糖均降解為木糖和木二糖，但不能作用于木二糖。通過(guò)XYNⅢ降解BWX和OSX的研究發(fā)現(xiàn)，XYNⅢ能夠水解木聚糖為木糖和木二糖，但不能作用于帶有側(cè)鏈的低聚木糖。
　　(2)從黑曲霉A.niger BE-2中克隆得到了一GH67家族α-葡萄糖醛酸酶基因gus67，該基因全長(zhǎng)2466

4、 bp，編碼821個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)分析表明，該基因與與黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88α-葡萄糖醛酸酶基因(accessionnumber: XM_001401166.1)和Aspergillus niger的aguA基因（accession number:AJ290451.1）的同源性達(dá)到99％;該基因編碼的蛋白GUS67理論分子量為91.61kDa，理論等電點(diǎn)為5.1，為親水性蛋白。
　　構(gòu)建了

5、α-葡萄糖醛酸酶基因(gus67)的畢赤酵母表達(dá)菌株GS115(pPIC9K-gus67)，并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的異源表達(dá)。誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖顯示在約130 kDa處有條帶，同時(shí)利用該酶水解4-O-甲基葡萄糖醛酸低聚木糖，結(jié)果證明了該酶具有α-葡萄糖醛酸酶活性。
　　(3)從竹屑中提取了半纖維素并表征了其結(jié)構(gòu)組成。半纖維素提取率為19.24％;結(jié)構(gòu)表征分析得出該半纖維素為聚-L-阿拉伯糖-（4-O-甲基-D-葡萄糖

6、醛酸）-乙?；?D-木糖;定量分析了竹屑半纖維素的糖組分:木糖、阿拉伯糖、葡萄糖以及糖醛酸的含量分別為79.88％、5.06％、1.13％和7.71％。
　　(4)研究了半纖維素酶協(xié)同降解竹半纖維素的效果。當(dāng)反應(yīng)條件相同時(shí)，木聚糖酶(XYNⅢ)與α-葡萄糖醛酸酶(GUS67)和阿拉伯糖苷酶(AnAxh62A)與進(jìn)行聯(lián)合酶解或協(xié)同降解竹半纖維素的低聚木糖產(chǎn)率，均比木聚糖酶XYNⅢ單獨(dú)酶解竹半纖維素的低聚木糖產(chǎn)率高。其中當(dāng)利用XYNⅢ