高溫纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及其基因克隆和酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、纖維素是自然界分布最廣泛,最廉價的可再生資源,纖維素酶是纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為直接能源的關(guān)鍵,纖維素酶的研究也是近年來世界范圍內(nèi)的一個熱點(diǎn)。
　　 本文從高溫堆肥中分離得到了多株纖維素降解菌,其中包括細(xì)菌、真菌及放線菌。經(jīng)過復(fù)篩,得到了三株具有優(yōu)良產(chǎn)酶特性的菌株,并分別進(jìn)行了鑒定,包括菌株的形態(tài)特征、菌落培養(yǎng)特征、系列生化鑒定及16s rDNA分子鑒定,鑒定結(jié)果是:菌株W-5為褐色高溫雙歧菌(Thermobifida fusca),

2、命名為Thermobifidafusca W-5,菌株F-7為白色高溫雙歧菌(Thermobifida alba),命名為Thermobifidaalba F-7,菌株S-1為青綠色糖單孢菌(Saccharomonospora viridis),命名為Saccharomonospora viridis S-1。對菌株Saccharomonospora viridis S-1的初步研究發(fā)現(xiàn),其有降解木聚糖酶的能力,但纖維素酶活力極低。而T

3、hermobifida fusca W-5和Thermobifida alba F-7均可在CMC平板生成明顯的水解圈,證明兩者能夠產(chǎn)生纖維素酶。使用赫奇遜濾紙培養(yǎng)基對以上兩者進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)其都有崩解濾紙的能力,初步檢測顯示二者都具有濾紙酶活,微品纖維素酶活及木聚糖酶活,說明兩者纖維素酶系統(tǒng)較齊全,有一定的應(yīng)用前景。
　　 對菌株Thermobifida fusca W-5發(fā)酵粗酶液的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步測定,其最適反應(yīng)pH為5

4、.0-6.5,在pH4-8.5區(qū)間內(nèi)可保持50％以上的酶活力;最適反應(yīng)溫度為70℃,在55℃-85℃之間,可保持50％以上的酶活。高溫70℃處理1小時酶活較未處理時變化不大,熱穩(wěn)定性較好。此外該菌產(chǎn)木聚糖酶能力也較強(qiáng),且其木聚糖酶的耐熱性也很好,對該菌產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行了初步的碳、氮源種類的優(yōu)化,使用木糖渣和秸稈粉等天然碳源時,菌株產(chǎn)酶能力較優(yōu),酵母粉、尿素和和蛋白胨更利于其生長和產(chǎn)酶。碳氮源種類優(yōu)化結(jié)果顯示該菌更傾向利用天然底物,降解天然

5、纖維素能力較強(qiáng)。因此,無論是作為纖維素酶的工業(yè)生產(chǎn)菌株,還是直接用于天然生物質(zhì)降解,Thermobifida fusca W-5都有一定的應(yīng)用前景。
　　 克隆了菌株Thermobifida fusca W-5的cel9b和cel5b兩種纖維素酶基因,并構(gòu)建了表達(dá)載體pET22b-cel9b及pET22b-cel5b,在宿主菌Rosetta(DE3)pLysS中進(jìn)行了表達(dá)研究。Cel9B分子量約為100 kD,最適作用溫度為74

6、℃,最適作用pH5.0,在pH5.0-7.0時可保留90％左右的酶活。溫度穩(wěn)定性非常好,70℃處理1小時尚保留85％的酶活。Cel5B分子量約65 kD,最適作用溫度約80℃,70℃處理30 min可保留約40％以上的酶活,溫度溫度性較好,最適作用pH偏酸,但在pH4.5-pH9.0時,可表現(xiàn)70％以上酶活。
　　 根據(jù)纖維素酶基因cel9b的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),首先對其進(jìn)行了部分結(jié)構(gòu)域缺失突變,構(gòu)建了重組載體pET22b-cel9b-n

7、-cbd-cbd-cd,pET22b-cel9b-cd,pET22b-cel9b-cd-c-cbm,并進(jìn)行了異源表達(dá)。研究了各缺失突變重組酶的酶學(xué)性質(zhì),結(jié)果顯示所有缺失突變的酶與原始酶相比最適作用溫度有所下降,最適作用pH基本沒有變化。Cel9B的N端CBM對其酶活性起關(guān)鍵作用,而兩端CBM都缺失的Cel9B-CD不僅分子量小,而且與原始酶的比活差別不大。
　　 針對Cel9B的耐高溫和Cel5B的耐堿性質(zhì),通過氨基酸序列比對和