菲降解菌分離鑒定、降解基因克隆與表達及菲跨膜作用研究.pdf

1、本文通過選擇性富集培養(yǎng)，從上海煉油廠附近污染土壤中分離到兩株菲降 解細菌，及一株可加速菲降解菌的菲降解速率的細菌，并對所分離菌株進行了 生化鑒定以及系統(tǒng)發(fā)育研究，同時進行了降解特性、代謝途徑、降解基因克隆 及表達方面的研究，對菲的膜毒性機制進行了初步的探討性研究。以期為建立 有效的菲污染預(yù)警指標體系和PAHs污染的生物修復(fù)提供有益的參考。 本研究所獲主要結(jié)論如下： 1、從石油污染土壤中篩選分離到兩株菲降解菌株，分別命名為ZP

2、1和ZP2菌 株，同時分離到一株可加速菌株ZP1對菲降解速率的菌株，命名為ZP5菌株。通 過革蘭氏染色、細菌形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測試、抗生素抗性實驗、碳源利用 實驗、全細胞脂肪酸分析、G+Cmol％含量分析以及16SrDNA序列同源性分析， 證明ZP1、ZP2和ZP5菌株這三株菲降解細菌應(yīng)分別屬于鞘氨醇單胞菌屬、假單 胞菌屬及Tistrella屬。其中菌株ZP1被鑒定為少動鞘氨醇單胞菌種(Sphingomonas pauc

3、imobilis)的又一菌株，ZP2被鑒定為施氏假單胞菌種(Pseudomonas stutzeri)， 這是首次報道施氏假單胞菌種菌株具有菲降解活性。 2、ZP1和ZP2兩株菲降解菌都有很好的溫度、pH及菲含量適應(yīng)性。少量 蛋白胨、酵母膏及葡萄糖的加入可不同程度的加速兩株菌對菲的降解；氯化銨、 硝酸銨和硫酸銨為氮源時對這兩株菌的菲降解速率幾乎沒有影響；菲濃度范圍 從250ppm到1000ppm之間，ZP1和ZP2菌株都可良好

4、生長并快速降解菲；表 面活性劑Brij30和Trition100在低濃度時對ZP2菌降解菲的速率有促進作用， 但對ZP1菌株的菲降解作用有明顯的抑制作用，Tween80在實驗的三個濃度梯 度中對ZP1和ZP2均表現(xiàn)出一定的加速菲降解速度效應(yīng)。 3、酶活實驗證明，ZP1和ZP2菌株都有較高的1,2-鄰苯二酚雙加氧酶2,3-鄰 苯二酚雙加氧酶活性，特別是2,3-鄰苯二酚雙加氧酶活性。在兩個菌株的菲代謝 過程中，都發(fā)現(xiàn)了鄰苯二甲酸

5、代謝途徑中的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物1-羥基-2-萘甲酸和2- 羥基-1-萘甲酸及鄰苯二甲酸，所以推測兩個菌株都是經(jīng)過鄰苯二甲酸途徑利用 菲為碳源而實現(xiàn)對它的降解。 4、根據(jù)己知序列設(shè)計引物在菌株ZP1中擴增得到芳香環(huán)經(jīng)化雙加氧酶鐵硫 蛋白α大亞基編碼基因，命名為pha-ZP1，其在Genbank登陸號為EU082776，該 基因全長1287bp，編碼383個氨基酸。利用Cn3D4.1軟件和Swiss Model Workspace 網(wǎng)

6、絡(luò)工具(http://swissmodel.expasy.org)推導(dǎo)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示其具有 Rieske型[2Fe-2S]中心和單核鐵原子結(jié)合域這兩個在酶的催化功能上具有重要作 用的保守結(jié)構(gòu)。并且其氨基酸序列與來自Sphingomonas yanoikuyae B1和 Sphingomonas sp.P2的鐵硫蛋白α亞基同源性高達97％。 5、根據(jù)已知序列設(shè)計引物分別在菌株ZP1和ZP2中擴增得到了各自的鄰苯二 酚雙

7、加氧酶基因，分別命名為phn-ZP1和phn-ZP2，它們在Genbank中的注冊登陸 號分別為：EU082777和EU082777。利用Cn3D4.1軟件和Swiss Model Workspace 網(wǎng)絡(luò)工具(http://swissmodel.expasy.org)推導(dǎo)了基因所編碼蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。 通過與已知基因序列和編碼氨基酸序列的比對，對兩段基因進行了遺傳親緣分 析。ZP1菌株C230基區(qū)phn-ZP1全長797bp，

8、編碼233個氨基酸，其二級結(jié)構(gòu)主要 為α螺旋和β鏈結(jié)構(gòu)，phn-ZP2基因全長1047bp，編碼331個氨基酸，其二級結(jié)構(gòu) 同樣主要為α螺旋和β鏈結(jié)構(gòu)。 6、通過基因重組將菌株ZP2的鄰苯二酚2,3-雙加氧酶編碼基因phn-ZP2在 Rosetta進行了成功表達，初步檢測結(jié)果顯示，重組菌株的酶表達活性要明顯高 于出發(fā)菌株。 7、卵磷脂脂質(zhì)體作為模擬細胞膜被用來研究PAHs的跨膜特性和膜毒性。 結(jié)果顯示，此類親脂性有機物在跨

9、膜的過程中符合Nemst分配定律。從而可以計 算出菲在卵磷脂脂質(zhì)體和水之間的分配系數(shù)。研究了離子強度、溫度、酸度等 條件對分配作用的影響。此外，首次研究了菲在卵磷脂微囊與模擬細胞液之間 的反分配作用。文中利用大腸桿菌及菲降解菌ZP1進一步研究了菲在不同細菌上 的跨膜作用。實驗表明相對于大腸桿菌，菲更容易進入降解菌的細胞膜內(nèi)，而 展開進一步的降解；在膜上的累積從而導(dǎo)致膜通透性的降低，是芳香環(huán)類有機 物表現(xiàn)毒性的可能原因；親脂性