菲高效降解菌的馴化、分離、鑒定及其降解菲的特性與機理研究.pdf

1、多環(huán)芳烴(polycyclicaromatichydrocarbons，PAHs)是一類廣泛存在于環(huán)境中的有機污染物。大多數(shù)的多環(huán)芳烴具有“三致”作用，通過食物鏈的傳遞會對生態(tài)環(huán)境和人體健康造成極大危害，因而這類化合物引起了環(huán)境學家們的關(guān)注。如何利用微生物的降解作用將其從環(huán)境中去除已成為人們研究的熱點問題。 本論文以菲為多環(huán)芳烴生物降解研究的模型物，主要研究內(nèi)容包括：(1)多環(huán)芳烴菲降解菌的馴化、篩選和分離；(2)降解菌株GY

2、2B的鑒定、抗生素敏感性試驗以及質(zhì)粒的提取試驗；(3)菲的降解特性研究，以及溫度、pH、外加營養(yǎng)物質(zhì)和初始底物濃度等因素對菌株GY2B的生長和菲降解的影響；(4)菲降解菌的底物降解范圍研究；和(5)菲生物降解中間產(chǎn)物的分析及其代謝途徑的推導。 選用水-硅油雙相體系和單一水相體系兩種方法來馴化多環(huán)芳烴降解菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水-硅油雙相體系篩選出的三種混合菌系：GY2、GS3和GM2對菲的降解效果要好于單一水相體系篩選出的菌。進一步研究

3、確認這三種混合菌系在72h能分別降解99.9﹪、99.9﹪和91.9﹪的菲(初始濃度100mg/L)。通過平板涂布與劃線，從混合菌GY2中分離出一株菲高效降解菌GY2B，48h對菲的降解率達到99.1﹪。 鏡檢表明菌株GY2B為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，16SrDNA序列分析表明其和鞘氨醇單胞菌的同源性最高，初步鑒定它為Sphingomonassp.GY2B，該菌株的GenBank登陸號是DQ139343。菌株GY2B對四種常用的

4、抗生素：頭孢呋辛、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素表現(xiàn)敏感，對羥氨芐青霉素中度敏感。且菌株GY2B沒有明顯的質(zhì)粒DNA條帶。 菌株GY2B的最佳生長溫度是25～30℃，最佳pH值范圍是7.1～7.4，對菲的降解在pH值7～10范圍內(nèi)都比較高。試驗表明添加低濃度的蛋白胨或葡萄糖對細胞的生長和菲的降解都有一定促進作用，而葡萄糖的作用似乎更明顯一些。但高濃度葡萄糖(≥500mg/L)的加入對細胞生長會產(chǎn)生毒害作用。 當菌株GY2B以

5、10、60和100mg/L初始濃度的菲為唯一碳源時，48h菲的降解率均在99﹪以上，而230mg/L初始濃度下菲的降解率只有70﹪左右，此后菲濃度基本不再減少，到120h仍有大量的菲殘留，此時菌株GY2B的細胞也大量死亡。進一步研究證實了高初始濃度(250mg/L)的菲樣品中積累了一種中間產(chǎn)物——1-羥基-2-萘酸，之后的研究表明高濃度的1-羥基-2-萘酸對菌體細胞有抑制作用。另外，通過計算菌株GY2B在不同菲初始濃度下的比生長速率μ(

6、對數(shù)生長期)發(fā)現(xiàn)底物菲的初始濃度和菌株的比生長速率μ之間沒有顯著的相關(guān)性。 底物降解范圍實驗表明：菌株GY2B能夠以一定濃度的萘、菲、1-羥基-2-萘酸、2-萘酚、水楊酸、鄰苯二酚、苯酚、苯和甲苯為唯一碳源和能源進行生長和繁殖，但不能利用和降解低濃度的1-萘酚、鄰苯二甲酸和對苯二酚為唯一碳源生長。同時，菌株GY2B在降解水楊酸、1-羥基-2-萘酸和萘的過程中都有中間產(chǎn)物2-羥基粘康酸半醛，而降解鄰苯二酚的過程有產(chǎn)物己二烯二酸。

7、 試驗還發(fā)現(xiàn)菌株雖然不能利用1-萘酚為唯一碳源生長，且1-萘酚對細胞有抑制作用，但是當一定濃度的1-萘酚和一定濃度的菲共存時，菌株GY2B能利用和降解部分的1-萘酚。 UV-Vis分析發(fā)現(xiàn)混合菌GY2和菌株GY2B降解菲的產(chǎn)物中有羥基與芳香環(huán)相連的結(jié)構(gòu)以及酚酮結(jié)構(gòu)的化合物。另外還證明菌株GY2B降解菲的過程中有1-羥基-2-萘酸和2-羥基粘康酸半醛這兩種中間產(chǎn)物的產(chǎn)生。GC-MS分析發(fā)現(xiàn)菌株GY2B代謝菲的時候有中間

8、產(chǎn)物水楊酸，1-萘酚和1-羥基-2-萘酸，以及微量的1-羥基-2-萘醛和1-羥基-2-萘酸甲酯。而混合菌GY2的代謝物中除沒有水楊酸外，其余產(chǎn)物和菌株GY2B的一樣。 通過底物降解范圍試驗、UV-Vis和GC-MS分析，推導出菌株GY2B降解菲的途徑如下：在菌株GY2B的作用下，菲先開環(huán)生成1-羥基-2-萘酸甲酯和1-羥基-2-萘醛，然后轉(zhuǎn)化成1-羥基-2-萘酸，經(jīng)脫羧成為1-萘酚，再開環(huán)后生成水楊酸，通過鄰苯二酚間位途徑裂解